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EDRF/ÓXIDO NÍTRICO
La relajación de la fibra
muscular lisa como componente estructural activo de la pared vascular, da
origen a una directa vasodilatación. El agente que desencadena este proceso fue
en un principio conocido como el factor de relajación derivado del endotelio
(EDRF), descubierto por Furchgott y Zawadzki 1 en 1980. Este factor
es producido por la célula endotelial como consecuencia de estímulos
fisiológicos, del estrés o de los estímulos químicos que in vivo puedan ejercer la acetilcolina y/o la bradiquinina sobre
sus respectivos receptores en la pared endotelial.
Tras comprobarse que el EDRF
influía sobre el tono vascular general y en particular en el flujo sanguíneo
cerebral 2-5, se demostró que este factor tenía las mismas
características funcionales que el óxido nítrico (NO) o las de un compuesto
estrechamente relacionado con él 2,6-11, demostrándose también que
el NO era producido por una familia de enzimas que se llamarían las óxido
nítrico sintasas (NOS).
LA FAMILIA
ENZIMÁTICA ÓXIDO NÍTRICO SINTASA
Diferentes son las
denominaciones empleadas a la hora de identificar a las distintas isoformas
enzimáticas productoras del NO y nosotros adaptaremos aquí, desde el punto de
vista académico, la nomenclatura acordada en la XIV Reunión Internacional sobre
la nomenclatura farmacológica del NO y compuestos relacionados 12.
No obstante, no dejamos de reconocer que aunque estos acuerdos son necesarios
para identificar académicamente a las distintas isoformas de la NOS, el tema
entraña algunas lógicas dificultades. Somos conscientes de que este tema es
bastante confuso por el momento, dadas las múltiples localizaciones celulares
que puede tener una misma isoforma. A manera de ejemplo podemos indicar como la
isoforma purificada y clonada en las neuronas (nNOS) se encuentra también
expresada en el músculo esquelético 13, en los neutrófilos, en los
islotes pancreáticos, en los endotelios y epitelios del aparato respiratorio 14,
y en las vísceras del tracto gastrointestinal. La isoforma endotelial (eNOS) que
fue purificada y clonada en las células endoteliales también puede expresarse
en ciertas poblaciones neuronales del cerebro 15 y en las plaquetas 16.
Por último, en cuanto a la isoforma inducible (iNOS) que fue purificada por
primera vez en los macrófagos, su expresión ha podido ser observada en células
de diversos tipos, tales como las células musculares lisas y las células
endoteliales 17 y recientemente por nosotros en un pequeño número de
neuronas situadas en el hilio del hipocampo, en el cerebelo, corteza y otras
áreas del cerebro de ratas adultas normales, teniendo además esta isoforma
características diferentes entre las expresadas por diferentes tejidos de una
misma especie 18.
También la propia división de la
enzima NOS en constitutiva e inducible puede ser un tanto artificial, ya que
por ejemplo la isoforma eNOS puede ser inducida en ciertas situaciones tales
como el ejercicio crónico 19 o durante la gestación. También, la
isoforma nNOS puede ser inducida en ciertas situaciones desencadenadas por una
intensa actividad fisiológica o por procesos patológicos; por ejemplo, podemos
verla inducida durante la gestación, ya sea en los primeros días del desarrollo
embrionario 20-24, durante los primeros días del desarrollo
postnatal cerebral en animales normales o en aquéllos que sufrieron un periodo
de hipoxia durante el parto 25 o durante el periodo de reperfusión
que sigue a una isquemia cerebral de 30 minutos en cerebros de ratas adultas 26.
Por otra parte la isoforma iNOS parece estar presente constitutivamente en
algunos tejidos como son el epitelio bronquial humano 14, en el
riñón del gato 18 y en neuronas del hipocampo, corteza y otras áreas
cerebrales de ratas adultas. Nuestra experiencia viene a confirmarse en otros
tejidos, como ocurre en el riñón, donde las células que forman los túbulos
colectores distales en una rata normal muestran una ligera expresión de la
isoforma nNOS, que se ve incrementada en las ratas genéticamente hipertensas 27.
Estas mismas condiciones de inducción la hemos podido observar y describir
tanto para la isoenzima nNOS como la iNOS en la corteza cerebral de ratas,
inducidas biológicamente por el envejecimiento natural del cerebro 28.
Por ello, cualquier intento de
clasificación que se intente no se ajustaría a la realidad de los hechos,
haciendo imposible el recoger bajo una misma sigla o abreviatura todo este
fantástico mundo de posibilidades. No obstante, y por el momento, desde el
punto de vista académico y descriptivo, es absolutamente necesario establecer
un mínimo de consenso en el uso de las abreviaturas, con las que podamos
identificar a estas substancias neuroactivas de acuerdo con lo acordado por el
citado comité internacional. De esta manera se ha clasificado las NOS en al
menos dos isoformas, una de las cuales es constitutiva (cNOS) y la otra
inducible (iNOS) 2,29-35. Con la denominación cNOS identificamos a
la vez a dos isoformas; una denominada endotelial (eNOS), por estar
mayoritariamente presente en las células endoteliales de la pared de los vasos 2,36,
aunque a esta isoforma también se la reconoce, en diversos trabajos previos,
bajo las abreviaturas (NOS tipo III, NOS-3, ecNOS). La otra NOS constitutiva ha
sido denominada neuronal (nNOS) por encontrarse preferentemente en el cerebro,
medula espinal y sistema nervioso periférico, reconociéndose también en otros
trabajos con las abreviaturas (NOS tipo I, NOS-1, bNOS, ncNOS). Finalmente, la
isoforma de la NOS inducida por estímulos inmunológicos o inflamatorios se la
conoce como iNOS y también como en el caso de las anteriores en muchos trabajos
se la identifica con las abreviaturas (NOS tipo II, NOS-2, macNOS, hepNOS). En
la actualidad la presencia de las diferentes isoformas de la enzima NOS puede
observarse en numerosos tejidos de mamíferos 2,25,37,38, peces 39
e invertebrados 40-45.
En las especies humana, vaca,
rata y ratón, el 39% de los 1.144 residuos de iNOS del ratón están
universalmente conservados, pudiendo admitirse que mientras existe un 90% de
homología entre las isoformas equivalentes de la enzima NOS contenidas en las
diferentes especies, esta homología llega a representar un 53% entre las
isoformas de una misma especie. Sin embargo, estas homologías son bastante
menores si se comparan los insectos, los crustáceos, las aves, los reptiles y
las plantas, expresando así las distancias existentes en la línea evolutiva.
En estos estudios filogenéticos
sobre la enzima NOS, se conoce actualmente toda la secuencia de la cNOS en Drosophila, la cual es similar a la cNOS
descrita en las especies superiores ya citadas, siendo como en aquéllas
altamente dependiente de iones de Ca2+ y calmodulina 46.
La variedad existente entre los genes de las enzimas NOS podría ser debida a
polimorfismos alélicos, naturales o inducidos, o a que los genes de las NOS se
pudieran organizar a partir de genes preexistentes por duplicación,
reorganización y fusión 47.
La localización cromosómica de
los genes de las diferentes isoformas de la NOS ha sido determinada por Southern blotting, usando el cDNA
específico de cada isoenzima e hibridando líneas celulares humanas, de rata y
ratón. Estos genes forman una familia que se encuentra dispersa en tres
cromosomas. El gen de la isoforma nNOS (160 Kb, 29 exones, 1.433 aminoácidos)
aparece localizado en el cromosoma humano número 12 (12q 24.2) 48,49,
1992; Xu y col, 1993), el gen de la isoforma de la eNOS (21-22 Kb, 26 exones,
1203 aminoácidos) corresponde al cromosoma 7 50 y finalmente, el gen
de la isoforma iNOS (37 Kb, 26 exones, 1153 aminoácidos) se localiza en el
cromosoma 17, estando situados en este caso los genes a cada lado del
centrómero (17cen-17q 11.2) 12,50.
La actividad de la cNOS ha sido
detectada en varios órganos y tejidos tales como el tracto digestivo, timo,
piel y músculo esquelético 51. Específicamente, la cNOS actuaría tanto
en la célula endotelial como en las neuronas del sistema nervioso,
transformando la L-arginina en citrulina y produciendo equimolarmente el NO,
siendo su actividad dependiente de Ca2+/calmodulina. En la célula
endotelial la isoforma eNOS actuaría como transductor de agonista, estando su
actividad dependiente de la concentración intracelular de Ca2+ libre
que modularía así la síntesis del NO y por lo tanto el tono vascular.
Las isoformas neuronal y
endotelial de la NOS, aunque tienen similares propiedades, muestran claras
diferencias, ya que su localización en las células que las contienen es
distinta, siendo citosólica para la isoforma nNOS y asociada a membrana para la
isoforma eNOS 29,52. Esta última, al contener un sitio de
miristoilación en su extremo N-terminal 53, facilitaría su anclaje a
la membrana mediante el ácido mirístico. Por esta razón se la reconoce también
con el nombre de particulada 31,35,54. No obstante, se ha
demostrado, por mutagénesis en el sitio de miristoilación, que podría existir
una eNOS también citosólica 19. En este sentido es probable que las
eNOS, tanto la soluble como la particulada, sean un mismo producto génico.
Busconi y Mitchel 55 demostraron que la isoforma eNOS era también
palmitoilada, que es una condición fuertemente relaciona con la condición de
estar asociada a la membrana, sugiriéndose que la miristoilación era necesaria
pero no suficiente para su anclaje a la membrana y que el hecho de ser
palmitoilada reversiblemente podría controlar esta asociación. Las diferencias
entre la nNOS y la eNOS también han sido demostradas a través de su
inmunorreactividad, ya que estas isoformas reaccionan específicamente con
anticuerpos específicos poli y monoclonales desarrollados para su
reconocimiento 56.
La isoforma nNOS ha sido
localizada fundamentalmente en las células nerviosas, donde medidas bioquímicas
de su actividad, llevadas a cabo en diferentes regiones del cerebro, han
demostrado altas concentraciones de nNOS en el cerebelo, en el hipotálamo, en
el cerebro medio, en el estriado e hipocampo, y baja actividad en la medula
oblongada 57. La isoforma nNOS fue purificada en el cerebelo de rata
58,59 y clonada en el cerebro de rata 60 y humano 61.
La isoforma nNOS ha sido descrita como un homodímero soluble de 155 kDa 58,62
o también como un monómero de 150 kDa 58, mostrando una homología
con la citocromo P450 reductasa 60. La isoforma eNOS muestra un
tamaño de 135 kDa 53. Estas isoformas de la enzima cNOS, tienen
zonas de reconocimiento para el nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
(NADPH), para el flavina adenina dinucleótido (FAD), el flavina mononucleótido
(FMN), la calmodulina y para el grupo hemo (hierro protoporfirina IX) 30,60.
Todo ello hace que estas isoformas tengan semejanza con la familia de las
hemoproteínas monooxigenasas y con las enzimas que actúan en el citocromo P450 31,54.
Las isoformas cNOS son totalmente dependientes de Ca2+ y
calmodulina, actuando sobre la L-arginina, NADPH y el oxígeno molecular como
substratos y utilizando como cofactores los FAD y FMN 2,58,59,63,64.
Su actividad enzimática puede estar también controlada por fosforilización 65
e incrementada por otro cofactor, la tetrahidrobiopterina (H4B) 66.
La isoforma iNOS ha sido
detectada en el citosol de macrófagos purificados y activados de ratón 67-69,
mostrando una conformación dimérica y masa molecular de 135 kDa. Recientemente,
se ha descrito una isoforma de iNOS en plaquetas humanas de 200 kDa 70.
La iNOS también ha sido localizada en hepatocitos, células tumorales,
neutrófilos, células plasmáticas, linfocitos, células mesangiales, células
endoteliales y células musculares lisas de la pared vascular 2,71.
Esta actividad enzimática, que en un principio no fue detectada en tejidos de
animales normales, sí lo fue en macrófagos de ratón de las líneas celulares RWA
264.7 y por nosotros mismos, en macrófagos de ratón de la serie J774 y en
monocitos y macrófagos humanos, tras el bloqueo de su receptor CD23
por la inmunoglobulina IgE o por anticuerpos monoclonales contra el CD23.
Esta caracterización fue realizada mediante el uso de la microscopía óptica y
electrónica 72. En muchos casos la expresión de la isoforma iNOS es
dependiente de lipopolisacáridos (endotoxinas) y citoquinas proinflamatorias 51.
También la isoforma iNOS puede expresarse en las células nerviosas de la
corteza cerebral de ratas que han sido sometidas a hipoxia y deprivación de
glucosa 73 o de cerebros que han sufrido una agresión isquémica
intensa y permanente durante la edad adulta o durante el parto 25 o
en ratas sometidas a estrés crónico 74. La enzima para su completa
actividad requiere NADPH, FAD y FMN y en cierta medida H4B y
glutatión 67, no necesitando, a diferencia de las isoformas cNOS, Ca2+
ni calmodulina adicional para la síntesis de NO, estando la Ca2+/calmodulina
fuertemente unida a la molécula.
La iNOS también fue clonada en
los macrófagos de ratón 69,75-77, demostrándose que esta enzima era
distinta a las dos isoformas constitutivas conocidas y siendo, además, la iNOS
humana clonada a partir de condrocitos y hepatocitos.
Como caso especial se ha
señalado que las células endoteliales presentan una NOS Ca2+-dependiente
y otra NOS Ca2+-independiente que son ambas capaces de incrementar
en la célula diana, tras la producción del NO, la guanilato ciclasa soluble 78,
siendo por esta circunstancia el primer ejemplo de un tipo celular que puede
poseer a la vez los dos tipos de NOS, la constitutiva y la inducible, lo que
justificaría que en los cultivos de células endoteliales de cerebro de ratón se
puedan producir grandes cantidades del NO después de ser activadas con el
interferón-γ, en combinación con cualquier inmunoactivador 79.
La isoforma NOS endotelial inducida por citoquinas es inhibida por los análogos
de L-arginina, con un rango potencial idéntico a aquel observado en los
macrófagos activados 79. Una actividad iNOS ha sido también descrita
en la célula muscular lisa de la pared vascular, dependiendo la formación de NO
de H4B pero no de Ca2+/calmodulina 80.
NADPH-DIAFORASA
/NOS
La isoforma nNOS fue en un
principio localizada inmunocitoquímicamente en diversas poblaciones neuronales
del cerebro de rata y en neuronas distribuidas en diversos órganos de la rata,
mono y humano 56,58,60, conociéndose hoy en el cerebro de rata su
amplia distribución 37, así como su correlación con aquellas
estructuras celulares que contienen cGMP, que actúa como sustancia receptora
del NO 81. Del mismo modo, hoy se tiene una clara información sobre
la existencia de estos grupos neuronales nitrérgicos mediante el uso de la
técnica histoquímica de la NADPH-diaforasa realizada en diversas especies 82-87.
Sobre la colocalización de la nNOS inmunorreactiva y la NADPH-diaforasa ha
existido y existirá aún cierta controversia, porque en algunos casos ésta no se
da completamente, atribuyéndose esta falta de coincidencia a los efectos que
sobre la actividad NADPH-diaforasa puede ejercer la fijación con
paraformaldehído 88,89. Sin embargo, Terenghi y col 90
demostraron una buena correlación entre la actividad NADPH-diaforasa y la
inmunorreactividad para la isoenzima nNOS en secciones de médula espinal
fijadas con 1% de paraformaldehído.
La NADPH-diaforasa purificada
aparece como una proteína simple de 150 kDa similar a la nNOS, habiendo sido
esta isoforma inmunoprecipitada por un anticuerpo que reconoce a la
NADPH-diaforasa 83. Por otra parte, la transfectación de células de
riñón humano con el cDNA de la isoforma nNOS permitió la detección de la
actividad tanto para la NADPH-diaforasa como para la isoforma nNOS, y además se
puso en evidencia el hecho de que ambas actividades residían en la misma
proteína 85. Basados en estas aportaciones se ha considerado, en
estudios llevados a cabo en cerebros de primates y de rata, que la NADPH
diaforasa y la nNOS son coincidentes 23,60,85,86,91.
La presencia en el sistema
nervioso central de la isoforma de la nNOS fue descrita ampliamente mediante el
uso de técnicas inmunocitoquímicas aplicadas a la observación con el
microscopio óptico 37 y con ayuda de la microscopía electrónica 92.
En el sistema nervioso central, amplias zonas del telencéfalo mostraban
neuronas positivas para la isoforma nNOS, especialmente en todas las áreas
corticales, el núcleo medioventral endopiriforme, el claustrum, el bulbo
olfativo principal y accesorio, los núcleos olfatorios anteriores y
posteriores, el hipocampo precomisural, la tenia tecta, el núcleo acumbens, la
stria terminalis, el caudado, el tubérculo olfatorio, las islas de Calleja, el
septum, el globo pálido, la substancia innominada, el hipocampo y la amígdala.
En el diencéfalo, la inmunorreactividad fue intensamente distribuida tanto en
el hipotálamo como en el tálamo. En el hipotálamo numerosas neuronas positivas
se localizaron en la pared del sistema periventricular neurosecretor y en los
cuerpos mamilares, además de estar presentes en la eminencia media del sistema
infundibular. En el mesencéfalo se mostraron neuronas positivas en el área
ventrotegmental, en el núcleo interpeduncular, en el núcleo rostral linear y
núcleo dorsal del rafe, en los núcleos de la substancia gris central y
peripeduncular, en la porción lateral de la sustancia negra, en el núcleo
geniculado, y en el colículo superior. En el puente numerosas neuronas se
describieron formando parte del núcleo pedunculopontino, del núcleo laterodorso
tegmental, del núcleo parabraquial y del locus coeruleus. La médula oblongada mostraba
neuronas inmunoteñidas en el núcleo sensitivo principal del trigémino, en el
cuerpo trapezoide, en el rafe magno, en los núcleos reticulares del puente, en
el núcleo prepósito del hipogloso, en los núcleos medial y espinal del
vestibular, en el núcleo dorsal coclear, en el núcleo medular reticular y en el
núcleo del tracto solitario, en los núcleos gracilis y cuneato, en el núcleo
dorsal del nervio vago y en los subnúcleos oral, interpolar y caudal del
espinal del trigémino. En el cerebelo se mostraron esta isoenzima las neuronas
estrelladas y las cestos, algunas células aisladas de Purkinje, localizadas
preferentemente en las regiones paraflocular y del vermis, las neuronas grano y
ocasionalmente, algunas neuronas de los núcleos cerebelosos. En otras especies
como el mono 93 ha sido también demostrada esta amplia distribución
de la isoforma nNOS.
Comparando los mapas de
distribución en el cerebro de las neuronas que eran positivas para nNOS y las
que mostraban actividad para NADPH-diaforasa, el tema de la correlación no está
tan claro. En muchos núcleos, tal como Hope y col 83 señalaron,
todas las neuronas que contenían actividad NADPH-diaforasa también fueron
positivas para nNOS, haciendo posible que la actividad NADPH-diaforasa
estuviera presente en neuronas activamente productoras de NO y que las técnicas
tanto inmunocitoquímicas como histoquímicas dieran resultados semejantes. No
obstante, también existían núcleos y neuronas concretas que sólo mostraban la
inmunorreacción para nNOS y no la actividad NADPH-diaforasa, lo que nos hizo
pensar en la posibilidad de que este tipo de núcleos o neuronas inmunopositivas
pero careciendo de actividad NADPH-diaforasa podrían ser consideradas como
neuronas silentes en cuanto a la producción de NO, al menos en el momento en
que se realizó el estudio 37. En la actualidad estos datos continúan
confirmándose en diferentes situaciones experimentales, demostrándose que
existen neuronas nNOS que no muestran actividad NADPH-diaforasa, tal como
ocurre en la corteza de ratas viejas o sometidas a
hipoxia/isquemia-reperfusión, donde hemos podido observar que aparecen un
número elevado de neuronas que expresan la proteína nNOS pero que son negativas
para la actividad NADPH-diaforasa 26,28.
SÍNTESIS DEL NO
Las diferentes isoformas de la
NOS juegan un papel muy relevante en muchas funciones fisiológicas,
dependientes todas ellas de la transformación del aminoácido L-arginina en
L-citrulina, produciendo a la vez equimolarmente el NO. La L-arginina está
implicada en el ciclo de la urea, permitiendo la generación de ornitina vía
citrulina. Este ciclo se encuentra completo en los macrófagos activados, pero
está sólo parcialmente representado en el cerebro, aunque sí podamos encontrar
en él compuestos intermediarios del ciclo, como son la ornitina, la citrulina,
el argininosuccinato y la L-arginina. No obstante, la enzima ornitina
transcarbamilasa, que cataliza la formación de citrulina desde ornitina y
carbamil fosfato está ausente en el cerebro. Este ciclo parcial de la urea en
el cerebro podría estar relacionado con la resíntesis de la L-arginina desde la
citrulina 64. Se ha sugerido que el ácido endógeno
argininosuccínico, precursor en el ciclo de la urea, puede modular la
biosíntesis del NO derivado del endotelio desde la L-arginina 94.
Aunque la síntesis de NO desde
la L-arginina y su liberación desde las células endoteliales está bien
demostrada, aún se argumenta si la actual molécula efectora es el NO, es un
precursor de NO, o es un complejo intermediario que contiene NO. En efecto,
parece haberse señalado que el EDRF librado desde el endotelio de la arteria
femoral del perro no puede ser identificado como NO libre, sugiriéndose que el
EDRF puede ser un precursor lábil del NO 36. Del mismo modo, el
activador de la guanilato ciclasa, generado en cultivos de células de
neuroblastoma de ratón durante la activación de los receptores muscarínicos, no
corresponde a ese originado desde el radical libre NO o hidroxilamina, aunque
parece originarse desde la guanidina o la L-arginina 95.
También se ha propuesto que el
EDRF debería ser un compuesto que contiene NO dentro de su estructura y que
debería actuar como un vasodilatador más potente que el NO mismo 36.
Presumiblemente correspondería a un nitrosotiol como el S-nitroso-L-cisteína 96,97.
Otra hipótesis propuesta indica al EDRF como un complejo nitrosil-hierro con
ligandos tioles con cisteína 98. Aunque no ha sido probada la
espontánea liberación de NO desde el S-nitrotiol 99, es concebible
que los grupos NO podrían ejercer un efecto similar al NO libre. Por ejemplo,
el 1-nitrosopirrolidina produce un bloqueo de los receptores excitadores
similar al producido por los donadores de NO, aunque no libera radicales de NO 100.
En la síntesis de NO por la
acción de la NOS en células de mamíferos intervienen 5 electrones del nitrógeno
guanidino de la L-arginina, 1,5 moles de NADPH y 2 de dioxígeno por cada mol de
NO formado. La reacción requiere además H4B, FAD, FMN, iones Ca2+,
calmodulina y grupo hemo como cofactores. La reacción consiste en dos actos
separados de monooxigenación, consistiendo el primer acto en la incorporación
de un átomo de O2 al substrato, a la vez que otro átomo se reduce
hasta agua, obteniéndose la N-hidroxi-L-arginina (NOH-L-Arg) como producto
intermedio. El segundo acto cuenta con que un electrón de la NADPH, otro de la
NOH-L-Arg y el O2 en forma de dioxígeno-hierro atacan al carbono
guanidino de la NOH-L-Arg, facilitando la incorporación de O2 y la
excisión de enlace C-N, liberando un átomo de nitrógeno y dando lugar a L-citrulina.
Además, en esta segunda reacción un átomo de O2 se reduce hasta agua
y otro se une al nitrógeno para formar el NO. Esta producción de NO puede ser
atenuada por diferentes inhibidores de la NOS derivados de la L-arginina 101.
INHIBIDORES DE LA
SÍNTESIS DE NO
Como inhibidores de la actividad
de la NOS, hemos de señalar a dos compuestos, la Nω-monometil-L-arginina
(L-NMMA) y la Nω-Nω-dimetil-L-arginina
asimétrica (L-ADMA) 102, que pueden producirse a partir de residuos
de arginina tras metilación durante la renovación proteica. Estos compuestos en
condiciones fisiológicas se encuentran en concentraciones bajas, pero en
situaciones patológicas, como es el caso de las afecciones renales, pueden
llegar a tener concentraciones bastantes elevadas que pueden disminuir la
síntesis de NO 102. Otros inhibidores como la Nω-nitro-L-arginina
(L-NNA), su ester la Nω-nitro-arginina metil ester (L-NAME) y
la N-iminoetil-L-ornitina (L-NIO) pueden inhibir de manera preferente a las
isoformas constitutivas de la NOS 79,103, mientras que la Nω-amino-L-arginina
y la aminoguanidina inhiben la iNOS de los macrófagos de una manera selectiva 30,102,104-107.
El inhibidor L-NAME parece
inhibir in vitro la síntesis de NO
por la isoforma eNOS 53,108,109 y la isoforma nNOS, incrementando la
presión sanguínea in vivo de forma
patente. Nosotros hemos observado que también inhibe la expresión de la
isoforma iNOS en situaciones de isquemia-reperfusión 26. Todos estos
compuestos suelen inhibir la actividad de las enzimas NOS de manera competitiva
y la exposición de estas enzimas al inhibidor L-NMMA durante un tiempo
prolongado provoca una desactivación irreversible de la enzima por alquilación 110.
También, el inhibidor N-[3-(aminometil)-benzil]-acetamida es un inhibidor de la
isoforma iNOS altamente selectivo, tanto in
vitro como in vivo 111.
Otro tipo de inhibidor es el difeniliodonio 112, que no tiene
similitudes estructurales con la L-arginina y no actúa de manera competitiva
con este substrato sino como un inhibidor irreversible y progresivo,
dependiendo su intensidad de acción de su concentración, tiempo de exposición y
temperatura.
Los inhibidores de la
calmodulina, tal como la trifluoroperazina, la clorpromazina y el
calmidazolium, pueden inhibir las tres isoformas de la enzima NOS de manera no
selectiva. También las isoformas enzimáticas de la NOS pueden ser inhibidas directamente
por el propio NO 113. Esta inhibición tendría como consecuencia una
cierta limitación de los efectos citotóxicos del NO. El monóxido de carbono
(CO) inhibe también las isoformas de la NOS purificadas. Los análogos de la
L-arginina (L-hemoarginina, L-arginil-L-aspartato, L-arginina metil ester) o
análogos de la citrulina (S-metil, S-etil-L-citrulina) y otros compuestos
aminoacídicos de bajo peso molecular pueden también inhibir la síntesis de NO.
Entre otros inhibidores de la
NOS que se están usando en la actualidad, está el 7-nitroindazol (7-NI) 109,114-116
que reduce la concentración de NO en el hipocampo tras la isquemia transitoria
llevada a cabo en el cerebro anterior. La N-acetil-3-O-metildopamina también
tiene efectos inhibidores por su efecto de bloquear la síntesis de H4B,
cofactor para la NOS. El uso de este inhibidor alivió el daño neuronal acaecido
en el hipocampo de rata tras la isquemia 117. También deben
considerarse con efecto protector de la acción del NO aquellos productos que
actúan inhibiendo el incremento de la guanilato ciclasa soluble, como es el
preparado lLY83,583 115, o las tetraciclinas, la doxiciclina y la
miociclina que bloquean la actividad de la microglía y con ello la producción
de iNOS 118. Por último, la droga antiepiléptica, la lamotrigina,
inhibe la liberación de los aminoácidos excitadores y por lo tanto la síntesis
de NO, decreciendo también con su administración los niveles de cGMP sin causar
una directa inhibición de la enzima NOS 119.
CARACTERÍSTICAS
DEL NO
El NO es un gas con propiedades
de los radicales libres, que actúa como una molécula mensajera de gran
inestabilidad y vida corta, difundiendo por cualquier punto de la membrana de
la célula productora, para actuar intercelularmente sin requerir ningún tipo de
transportador de membrana. En el caso de que la diana sea la célula muscular
lisa que forma la pared vascular, estimula en ella, una vez difundido a través
de las membranas celulares, la guanilato ciclasa soluble para catalizar la
síntesis del guanosina monofosfato cíclico (cGMP) 120 y con ello
inducir definitivamente la relajación muscular y por ende, la vasodilatación,
regulando el flujo y la presión sanguínea 10,121-123.
Existen situaciones clínicas en
las que la acumulación de NO puede contribuir a la aparición de ciertas
condiciones fisiopatológicas. Así, por ejemplo, puede ser deseable inhibir la
producción de NO, ya sea a través de las formas enzimáticas de la cNOS, caso de
la isquemia cerebral o en la epilepsia, en cuyos cuadros clínicos la sobreproducción
de NO por las formas enzimáticas de la NOS puede desencadenar una
neurotoxicidad muy activa, o ejercer la inhibición de la isoforma iNOS, como es
el caso del shock séptico o el producido en ciertas inflamaciones crónicas 12.
A titulo de orientación la potencia inhibidora de los productos antes citados
se resumen en el siguiente diagrama:
L-NMMA nNOS = eNOS > iNOS
L-NA nNOS = eNOS >> iNOS
L-NAME nNOS = eNOS >> iNOS
L-NAA nNOS = iNOS > eNOS
L-NIO iNOS > eNOS = nNOS
7-NI nNOS >> eNOS = iNOS (in vivo)
nNOS = eNOS = iNOS (in vitro)
Aminoguanidina iNOS
> eNOS = nNOS.
El NO es moderadamente soluble
en el agua, con una concentración en una solución saturada (1 atmósfera) de 1,8
mM a 25ºC, siendo mucho más soluble en solventes apolares tal como el N-hexano,
tendiendo a disolverse de manera selectiva en las membranas y en las fases
lipídicas de las células por ser altamente lipofílico. Usando microsensores no
selectivos para NO, se han demostrado altas concentraciones de NO en zonas adyacentes
a la membrana plasmática de una célula endotelial productora de NO 124,125.
Estos datos justifican como en la membrana celular el NO puede difundir
bidireccionalmente, usando a la membrana en ocasiones como reservorio, aunque
es importante señalar que el volumen total de la fase acuosa para el NO es
bastante mayor que el volumen de la bicapa de la membrana. La constante de
difusión del NO en agua es generalmente del rango de (2-4) x 10-5 cm2/s,
valor que se incrementa significativamente con la temperatura. Se ha calculado
que la difusión detectada mediante microsensores en condiciones fisiológicas
idóneas a 37ºC corresponde a 3,3 x 10-5 cm2/s. Basándonos
en estos cálculos, podemos señalar, en procesos de difusión simulada del NO,
que esta molécula puede perfundir sorprendentemente a largas distancias desde
las células que la producen hasta el punto de interacción con las células
dianas 126.
El NO es una molécula no cargada
que actúa como un radical libre, ya que de sus 11 electrones de valencia uno no
está apareado, siendo esta molécula paramagnética, lo cual es una propiedad
destacada entre sus características químicas. Entre las interacciones químicas
más comunes del NO en los sistemas biológicos destaca la estabilidad que
alcanza el electrón no apareado con otras especies paramagnéticas -oxígeno,
superóxido, radicales peróxidos- o la formación de complejos entre el NO y un
metal, dando origen en la mayoría de los casos a especies diamagnéticas
estabilizadas en las que el electrón no apareado está compartido entre el NO y
el metal.
En la fase de gas, la reacción
NO y O2 ha sido estudiada durante muchos años, ya que el NO tiene un
papel importante en la contaminación atmosférica, estando esta reacción
conformada por 2 moléculas de NO y una de O2 para producir 2
moléculas del dióxido de nitrógeno (NO2), otro radical
paramagnético:
2NO + O2 → 2NO2
En solución acuosa, la reacción
es similar. El dióxido de nitrógeno puede reaccionar con otra molécula de NO2
para formar tetraóxido de dinitrógeno (N2O4) o con otra
de NO para formar el trióxido de dinitrógeno (N2O3):
NO2 + NO2 → N2O4
NO2+ NO → N2O3
Tanto estas especies como el
ácido nitroso (HNO2) son altamente reactivas y ellas en la fase
líquida pueden ser consideradas como donadores de iones nitrosonio [NO+].
La química de la transferencia de los grupos nitrosonio es conocida como
translocación e indudablemente es una de las reacciones más estudiadas de los
óxidos de nitrógeno 127. Se transfieren a una variedad de
nucleófilos, incluyendo hálidos, nitrógeno y sulfuro. En el agua se forma el
ácido nitroso y por tanto la disolución de N2O3
suministra nitritos y la disolución de N2O4 proporciona
nitritos y nitratos.
[NO+] + OH- → HNO2
→ H+ + NO2-
[NO+] [NO2-]
+ H2O → 2NO2- + 2H+
[NO+] [NO3-]
+ H2O → NO2- + NO3-
+ 2H+
El único producto aislado de la
reacción del NO con O2 en agua es el nitrito 128, el cual
puede indicar la formación intermedia de N2O3, aunque
esto no está completamente claro. Otras dos dianas nucleofílicas biológicamente
importantes para la nitración son el nitrógeno y el sulfuro. En el caso del
nitrógeno el producto es una nitrosamina que es estable, aunque estas moléculas
son potentes mutágenos y cancerígenos, ya que su formación desde los óxidos de
nitrógeno generados enzimáticamente ha sido relacionada con la etiología de una
variedad de estados cancerosos que pueden surgir durante procesos inflamatorios
prolongados 129,130. Los átomos de azufre son también dianas para la
nitrosilación 96, como en el caso de los tioles donde se forma el
S-nitrosotiol:
RSH + [NO+] → RSNO + H+
El NO reacciona de manera muy
rápida con el superóxido para producir inicialmente el peroxinitrito:
NO + O2- → ONOO-
Este anión es altamente
oxidativo, capaz de oxidar tioles y las bases del DNA, además de iniciar la
peroxidación de lípidos independiente de la presencia de metales. En presencia
de ciertos metales, el peroxinitrito permite formar especies NO2+,
las cuales pueden nitrar compuestos fenólicos, incluyendo los anillos
aromáticos de las proteínas 131,132.
En estas condiciones
fisiológicas el conjugado ácido del peroxinitrito, el ácido peroxinitroso,
(ONOOH, pka = 6,8 a 25ºC) es altamente reactivo y posee la
reactividad de los radicales hidroxilos 133.
La ruptura homolítica del ONOOH
generará el radical reactivo •NO2, el cual puede
contribuir también a la toxicidad del ácido peroxinitroso 134. Sin
embargo, alguna proporción de ONOOH se deprotona espontáneamente para formar el
anión no reactivo nitrato 135.
Basado solamente en la reacción
química del NO con O2- esta claro que la producción de
peroxinitrito y ácido peroxinitroso tendrá un efecto dañino sobre las
biomoléculas, aunque la producción de nitrato puede dar lugar a una mutua
limpieza de NO y O2-.
El NO también reaccionará con
radicales peroxil. Esta reacción puede ser vista como una actividad
antioxidante del NO, donde las reacciones en cadena de los radicales lipídicos
son terminadas por la reacción del NO con los radicales alcoxil y peroxil. Como
productos de estas reacciones se incluyen los nitrito-, nitro-,
nitroso-peroxo-lípidos y lípidos nitrados. Otra potencial efecto antioxidante
del NO puede ser su reacción con el propio peroxinitrito 136.
Otras acciones del NO en los
sistemas biológicos están relacionadas con la reacción del NO con los metales
de transición, dado que muchos metales de importancia biológica muestran la
órbita d parcialmente rellena de
electrones y por lo tanto son excelentes lugares para los electrones no
apareados, tal como el existente en la molécula de NO. Muchas proteínas como la
hemoglobina, la mioglobina, la citocromo oxidasa, las peroxidasas, las
desoxigenasas, las mioglobinas y los citocromos P450 se unen al dioxígeno como
una parte integral de su función y por lo tanto hacen de ellos la diana del NO
por la similitud de esta molécula con el dioxígeno.
El complejo metal-nitrosilo ha
sido conocido desde hace muchos años 137, pero hasta hace unos pocos
fue asumido que con algunas excepciones, tales como los iones nitroprúsidos,
estos complejos eran poco reactivos. Sin embargo, es conocido que las
características de unión de los nitrosilos metálicos pueden dirigir grandes
cambios en la reactividad de los grupos nitrosilos. En condiciones biológicas
estos complejos pueden liberar NO o aniones nitroxil (NO-) o actuar
como agentes nitrosantes a través de la donación de NO+.
Dada su similitud al dioxígeno,
el NO ha sido utilizado como sustituto para el O2 en muchos
metaloproteínas, ya que los complejos nitrosos de sus centros metálicos son
paramagnéticos y por lo tanto la espectrometría por resonancia electrón
paramagnética (EPR) puede ser usada para obtener información sobre los
alrededores de estos centros. Las señales EPR son muy sensibles al tipo de
metal y a su estado de oxidación, así como a la naturaleza y disposición
espacial de los múltiples ligandos alrededor del centro metálico. Se han
descrito los espectros EPR de los complejos NO con metaloproteínas que
contienen hierro o cobre 138.
En las células de los mamíferos
la vida media del NO es relativamente corta (5-10 s) 11 y la máxima
concentración del NO está en rangos micromolares. Por ello la formación de
óxidos de nitrógeno más altos a partir de la reacción de NO con el O2
puede resultar más dañina para las células dianas que el propio NO.
Cuando se produce el NO in vivo o in vitro está claramente admitido que su efecto biológico
predominante dependerá del balance entre una variedad de diferentes y
simultáneas reacciones que se produzcan. Las consecuencias de la formación de
NO estarían dirigidas por i) las especies de óxidos de nitrógeno que se formen,
ii) por sus relativas velocidades de formación, iii) por la naturaleza de las
dianas disponibles en la vecindad y iv) por la rapidez con que reaccionan con
estas especies. Todo ello hace que los modelos y vías de acción del NO muestren
gran complejidad. Cuantitativamente, la reacción más importante del NO en los
mamíferos es la reacción con la oxihemoglobina. Esta reacción es una transferencia
de O2 más un electrón al NO, formando el anión nitrato y la
methemoglobina:
(HbFe2+)O2 + NO →
(HbFe3+) + NO3-
Esta reacción es extremadamente
rápida y dada la alta concentración del grupo hemo (25 mM) en el sistema
sanguíneo, hace que la síntesis in vivo
de NO pueda dar origen a cantidades significativas de NO3-
en la circulación. El NO reacciona también con la desoxihemoglobina para formar
complejos nitrosilos, siendo esta reacción también muy rápida 139.
En un medio aeróbico, una vez formada el complejo nitrosil-hemoglobina,
reaccionará con O2.
FUNCIÓN DEL NO
A la vista de todo lo anteriormente
expuesto, hay una amplia gama de procesos biológicos en los que el NO puede
estar implicado. Estos procesos incluyen diferentes mecanismos de activación de
los factores de transcripción, la translocación de los mRNA, el metabolismo del
hierro, la mutagénesis, la apoptosis, la glicólisis y el transporte de
electrones mitocondriales, la acilación de proteínas, la síntesis de
desoxinucleótidos, la fusión de mioblastos, la adhesión de las plaquetas y
neutrófilos, la proliferación de los promotores de células mieloides, la
producción de células T, de queratiniocitos y células tumorales, la liberación
de hormonas pituitarias, la regulación del tono bronquial y el de los
esfínteres, la regulación del peristaltismo esofágico, la contracción del
estómago e intestino, la del útero 140 y corazón, la regulación del
pulmón y la erección del pene, participando en la tolerancia y toxicidad de los
opioides 141, en la regulación de la memoria, sueño y presión
sanguínea 34,37,38,92,142-145.
NO Y SISTEMA
NERVIOSO
El NO en el sistema nervioso
difiere de los neurotransmisores clásicos o neuromoduladores en que i) el NO no
es almacenado en vesículas, ii) no actúa con mecanismos específicos de
liberación y captación, iii) no cuenta con receptores de membrana, penetrando
por afinidad lipofílica directamente en la célula diana, donde regula muchos
sistemas enzimáticos, iv) no es metabolizado por enzimas específicas, siendo
degradado espontáneamente por oxidación o por compuestos tales como el
superóxido o la oxihemoglobina, v) tiene una vida media de segundos en contra
de la de los neurotransmisores clásicos, que es de milisegundos 146,147,
habiendo sido estimada la distancia de difusión del NO en un medio proteico en
10 μm, que es bastante menor al diámetro de algunas células 126,148.
La actividad de la isoforma nNOS
está incrementada postsinápticamente por la acción estimuladora de ciertos
aminoácidos tales como el glutamato 64, que tras su liberación por
el terminal presináptico incrementa el flujo del Ca2+ hacia el
interior de la neurona, el cual activaría la NOS 63. Existen
evidencias indirectas de que todo este mecanismo es dependiente de glutamato,
el cual tras ser liberado en el espacio intersináptico actúa sobre sus
específicos subtipos del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA).
En el sistema nervioso central
se ha demostrado que la mayoría de las células que expresan inmunorreactividad
para NOS contienen una significativa cantidad del receptor NMDA R1, por lo que
este tipo de receptor puede ser la pieza clave en la puesta en marcha del
mecanismo citado 26,149. Recientemente, estos datos
inmunocitoquímicos y los obtenidos por hibridación in situ han sido confirmados mediante técnicas de microdiálisis 150.
Las dianas del NO liberado por las células nerviosas que contienen NOS
corresponden a las células que están situadas en el entorno de la célula
productora y que contienen la guanilato ciclasa soluble. De esta manera, el NO
liberado incrementaría, por ejemplo en el cerebelo, la hidrólisis del
fosfoinositol, sugiriéndose por lo tanto que el NO desempeñaría un papel de
mediador 151.
No obstante, grandes
concentraciones de NO en el cerebro pueden ser citotóxicas para muchas células,
debido a la pérdida funcional de grupos hemos e inhibición de la síntesis de
DNA y de la respiración mitocondrial de la célula diana 152. En
cultivos de células gliales del cerebelo el NO inhibe la mitogénesis y la
proliferación celular mediante inhibición de la actividad mitocondrial 153.
La inducción de la iNOS en cultivos de astrocitos produce la inhibición de la
actividad enzimática de las enzimas relacionadas con el grupo hemo, tal como la
citocromo oxidasa 154. Recientemente, nosotros hemos observado
nitración de estas enzimas mitocondriales, hecho que demuestra el efecto tóxico
sobre la mitocondria ante un exceso de NO.
Entre las funciones del NO en el
sistema nervioso podemos citar i) la autorregulación del flujo vascular tanto
periférico como central, ii) la activación de las fibras parasimpáticas que
innervan los vasos cerebrales 155, iii) el incremento del flujo
sanguíneo durante la hipercapnia, iv) la participación en los mecanismos de
defensa cerebral ante las infecciones mediante la microglía, que en estas
situaciones expresa grandes cantidades de la isoforma iNOS 73,156 y
v) su participación en procesos de plasticidad neuronal, aprendizaje y memoria.
Concretamente, por esta última
función al NO se le atribuye el carácter de neurotransmisor retrógrado, ya que
este gas puede viajar desde la membrana postsináptica a la presináptica,
participando en el fenómeno de potenciación de la actividad neuronal a largo
plazo (LTP) que tiene lugar por ejemplo en todos los casos de plasticidad
neuronal asociada con el aprendizaje y la memoria. Este mecanismo puede ser
bloqueado por inhibición de la enzima NOS con inhibidores específicos o por
hemoglobina, que reduce o elimina al NO del medio 157. En este
sentido se ha demostrado que la administración en el pollo del inhibidor L-NNA
antes de someter a este animal a un ejercicio de aprendizaje produce amnesia,
mientras que la administración del substrato L-arginina durante todo el tiempo
que dura la acción del inhibidor evita la aparición de la amnesia 158.
Estos hechos fueron confirmados en ratones "knockout" que carecen del gen de la
nNOS 159 o en ratas 160. Estas mismas circunstancias se
repiten cuando se administra otro tipo de inhibidores, tal como el L-NAME 161.
Concretamente, en el sistema
nervioso las acciones del NO no están confinadas a la estructura anatómica de
los elementos que regulan la circulación o flujo sanguíneo, sino que la
capacidad de difusión del NO llega a producir efectos más amplios que los producidos
a través de las uniones específicas que las células productoras del NO puedan
tener con las células con las que anatómicamente establecen contacto 162.
En el sistema nervioso el NO es considerado parcialmente como una sustancia
paracrina y parcialmente como un neurotransmisor, aunque se considera que actúa
más paracrinamente 162, participando en la sinaptogénesis, en los
procesos sensitivos, en la transducción de estímulos, en la plasticidad neural 23,24,163,
en el aprendizaje, en la regulación de la ingesta y en la toma de líquidos 92.
NO Y LOS PROCESOS
PATOLÓGICOS
La participación del NO en
diversos procesos patológicos en el sistema nervioso está claramente
establecida 164-167. Tras irrumpir en el mundo científico, durante
la pasada década el NO, como un importante mediador intercelular, se pudo
comprobar como sus niveles altos de producción estaban asociados en muchos
casos a una citotoxicidad celular no específica mediada por la activación de
procesos inmunes y por lo tanto relacionada con ciertas afecciones crónicas,
como son los procesos inflamatorios autoinmunes: la artritis reumatoidea, la
diabetes insulino-dependiente, ciertos procesos inflamatorios intestinales y la
esclerosis múltiple. Recientemente, se señala al NO como un inmunorregulador
que participa en la supresión de la función de los macrófagos y linfocitos T
activados e implicados en este tipo de procesos patológicos y por lo tanto
regulando la severidad de los procesos patológicos 168.
En relación con procesos
fisiopatológicos, el NO puede participar en los relacionados con la migraña, la
epilepsia, las agresiones sufridas por el cerebro en las que participan la
excitotoxicidad y en las enfermedades neurodegenerativas 25,26,37,73,92.
En la enfermedad de Huntington,
el NO liberado desde la isoforma nNOS puede mediar en la muerte celular
producida por la citotoxicidad relacionada con la alta producción de glutamato.
Aunque parece admitirse que la población de interneuronas del estriado que
contienen somatostatina, neuropéptido Y y nNOS sobreviven durante el desarrollo
de la enfermedad de Huntington, hoy se admite que estas neuronas están
seriamente dañadas durante el curso de la enfermedad, produciéndose una notable
reducción en la expresión de tanto el mRNA como la proteína de nNOS 169.
En la enfermedad de Alzheimer, se conoce que la dimetilarginasa, enzima que
destruye los inhibidores endógenos de la nNOS, está específicamente elevada en
aquellas neuronas con anormalidades en el citoesqueleto y sometidas al estrés
oxidativo relacionado con esta enfermedad. Por el contrario, esta enzima no fue
encontrada en las neuronas envejecidas tomadas como control. Parece lógico
pensar que la falta de inhibición de la nNOS en las neuronas que contienen
elevados niveles de dimetilarginasa puede haber contribuido al daño observado.
Estos datos señalan como en la enfermedad de Alzheimer existen grandes
alteraciones en regulación de la NOS 170,171.
En la enfermedad de Parkinson,
el estrés oxidativo puede contribuir a la muerte neuronal en la sustancia
negra, según datos obtenidos de material postmortem, donde se ha demostrado que
existe un incremento de los niveles de hierro y un descenso de los niveles de
glutatión, contribuyendo a dañar la función mitocondrial 172. Este
mecanismo permite que se produzcan daños oxidativos, tal como un aumento de la
peroxidación de lípidos, la nitración de proteínas y la oxidación del ADN. El
NO puede estar implicado en la producción de radicales hidroxilos, como
resultado de la difusión de dopamina inducida por el 1-metil-4-fenilpiridinio
(MPP+) en el estriado, y tanto los ratones "knockout" que carecen de
la nNOS como los tratados con 7-NI para inhibir la nNOS son relativamente
resistentes a los efectos neurotóxicos del MPTP 173,174. Además, se
ha demostrado la producción de nitración de los residuos de tirosina en
proteínas por el peroxinitrito, formando la nitrotirosina que se puede detectar
inmunocitoquímicamente con anticuerpos específicos contra este compuesto. Esta
inmunorreactividad se ha demostrado en los cuerpos de Lewis de las neuronas que
contiene pigmentos de melanina y depósitos de material amorfo 175.
En la esclerosis lateral
amiotrófica, se pensó que la nitración de los neurofilamentos estaba
relacionada con la patogénesis de esta enfermedad, donde se ha detectado
niveles altos de 3-nitrotirosina en la médula espinal, aunque la
inmunorreactividad para la nitrotirosina se localiza también en agregados
neurofilamentosos de las neuronas de corteza. Se ha argumentado que la síntesis
del NO en este tipo de enfermedad se debe a la isoforma nNOS en estas neuronas
y se ha propuesto que el NO puede jugar un importante papel en este tipo de
patología 174. Recientemente, se ha demostrado que la subunidad
ligera de los neurofilamentos eran particularmente susceptibles para la
nitración mediada por el peroxinitrito, aunque no se apreciaron diferencias
claras con los controles usados 176,177.
En la esclerosis múltiple, se
han dado algunas explicaciones para justificar la destrucción de la mielina y
los oligodendrocitos, aunque no está aún perfectamente probado el mecanismo
exacto por el cual este tipo de lesión se produce 178. Sherman y col
179 postularon que la respuesta inmune en la esclerosis múltiple se
da como consecuencia de una acción mediada por las citoquinas que incrementan
en el sistema nervioso central la producción de NO por los
macrófagos/microglía, por las fibras musculares lisas y por el endotelio
vascular. Tres mecanismos se han propuesto para justificar el daño celular: i)
el producido por una directa acción tóxica producida por el NO, ii) por la
lesión debida a la acción del peroxinitrito tras su formación por la reacción
del NO con el anión superóxido y iii) por la elevación del CGMP mediado por el
NO, incrementando el factor TNF-α. Estas hipótesis se apoyan en el hecho
de que los antiinflamatorios como la dexametasona y el TGF-β disminuyen
los síntomas de la esclerosis múltiple y de la encefalitis alérgica
experimental, respectivamente, e inhiben la inducción de las citoquinas que
median en la producción de NO por los macrófagos 179.
En el sistema nervioso
periférico existen varias neuronas sintetizadoras de NO que participan en la
relajación muscular no adrenérgica no colinérgica (NANC), de tal manera que el
NO liberado por estas fibras y cuerpos neuronales que integran este sistema
nitrérgico participa en la relajación del músculo liso 98,145 y
cardiaco y posiblemente la regulación del tono bronquial 143 y en la
regulación del tono del músculo estriado. En el músculo liso gastrointestinal,
el papel esencial del NO se demuestra por la dilatación del estómago e
hipertrofia del esfínter pilórico y del músculo de la capa circular que ocurren
en los ratones "knockout" que carecen de la nNOS 180. Lo mismo
ocurre en la regulación metabólica del hígado del gato y trucha 39,181. Las neuronas nitrérgicas cardiacas influyen
tanto sobre el sistema de conducción cardiaco como sobre las fibras musculares
que conforman el miocardio, mediando así las influencias autónomas
inotrópicamente negativas 182. Similarmente, el NO que se produce en
el sarcolema de las fibras rápidas del músculo esquelético disminuye su
contracción. En el esófago, las fibras NANC regulan el peristaltismo, pudiendo
modular el tono de la fibra muscular esquelética mediante la presencia de
placas motoras que son inmunopositivas para la nNOS 38,183, y
participan en la transducción sensorial de los estímulos mecánicos que se
ejercen sobre el epitelio esofágico al paso del bolo alimenticio. Existen
fibras nNOS-positivas que surgen de las fibras perivasculares y que se
distribuyen libremente por ese epitelio, pudiendo corresponder al sustrato
anatómico base de un posible reflejo sensitivo-motor 38 descrito
previamente por Burnstock 184.
En el pene las fibras
nitrérgicas juegan un papel preponderante en la erección, a través de la rica
inervación que estas fibras presentan en el seno cavernoso y en los vasos de
diferente diámetro que se extienden por todo este órgano, pudiendo, claramente
las alteraciones en este sistema, producir una más o menos grave disfunción 185.
Recientemente, hemos demostrado cómo la degeneración selectiva del las fibras
nitrérgicas juega un papel importante en la impotencia ligada a la diabetes
experimental 144. No obstante, parece ser que la diabetes no afecta
la actividad y localización de la enzima NOS en el músculo anococcígeo de la
rata 186.
En el sistema cardiovascular las
tres isoformas del NOS tienen implicaciones en su fisiología y fisiopatología.
La eNOS es importante en la regulación vascular, manteniendo una vasodilatación
adecuada y protegiendo la íntima de los agregados plaquetarios y de la adhesión
leucocitaria, además de inhibir la proliferación del músculo liso de la pared.
La isoforma nNOS del sistema nervioso central y periférico puede también
contribuir a regular la presión sanguínea. En las enfermedades asociadas a
hipercolesterolemia, diabetes e hipertensión, que están caracterizadas por una
disfunción endotelial, se ve reducida la capacidad de vasodilatación mediada
por el endotelio. El estrés oxidativo y la inactivación del NO por los aniones
superóxido juegan un papel importante en estos estados patológicos. La
administración de L-arginina como sustrato de NOS o H4B como
cofactor puede aliviar la disfunción endotelial en varias de estas condiciones.
En las lesiones cerebrovasculares, la isoforma nNOS y la iNOS juegan un papel
clave en la neurodegeneración, mientras que la eNOS tiene importancia para el
mantenimiento del flujo sanguíneo cerebral y la prevención, en cuanto sea
posible, del daño neuronal. En la sepsis la iNOS está inducida en la pared
vascular por las endotoxinas bacterianas y/o la citoquinas proinflamatorias,
produciendo grandes cantidades de NO que actúa como un importante mediador en
la vasodilatación arteriolar inducida por endotoxinas y el shock séptico 187.
NO Y LOS PROCESOS
DE HIPOXIA/ISQUEMIA
En relación con la participación
del NO en la hipoxia/isquemia cerebral se conoce bastante bien el hecho de que
el NO no sólo participa directamente en diversos mecanismos funcionales y
protectores, sino también en numerosos procesos neurotóxicos 188.
Como agente neuroprotector, al NO se le atribuyen diferentes acciones
fisiológicas: i) por la estimulación que produce sobre la guanilato ciclasa
soluble para formar el CGMP en la célula diana 2,189, produciendo la
relajación de la pared vascular y con ello la vasodilatación y mejora del flujo
sanguíneo 190; ii) por bloquear directamente el incremento de Ca2+
intracelular mediado por el estímulo del receptor NMDA 191; iii) por
inactivar mediante nitrosilación a dicho receptor; y iv) por las propiedades
antioxidantes que posee el NO 192,193.
El efecto neuroprotector
inmediato se produce por el incremento de NO sintetizado por las células
endoteliales a partir de la eNOS, justo en el momento de iniciarse la
hipoxia/isquemia, en un intento de evitar el daño isquémico mediante una
vasodilatación de urgencia 194. La subsiguiente sobreexpresión de
las otras isoformas de la NOS es de gran importancia en la fisiopatología de
los cuadros clínicos producidos por la hipoxia/isquemia, que pueden acarrear
consecuencias neurológicas e incapacidades graves. La nNOS puede participar
beneficiosa y activamente no sólo en procesos relacionados con la
neurotransmisión y/o neuromodulación 195 y con la plasticidad
neuronal después de distintos tipos de injuria acontecidos en la médula espinal
196, sino también con los episodios de hipoxia cerebral sufrida por
fetos a término en el momento del parto 25, durante el período
postnatal y durante la vida adulta 196. Esta actividad
neuroprotectora parece tener un papel importante en la actividad funcional del
hipocampo 198-200 y del cerebelo 201.
Como agente neurotóxico, al NO
se le implica directamente en mecanismos citotóxicos e independientes de CGMP,
tales como la formación de radicales libres, nitrosilación de ácidos nucleicos,
roturas del ADN e inactivación de enzimas con centro ferrosulfurados que
alterarían los procesos energéticos celulares 202. En este sentido,
la hipótesis más interesante relacionada con el efecto neurotóxico del NO es la
formación de peroxinitrito como consecuencia de su interacción con el anión
superóxido 203. El peroxinitrito puede nitrar, directamente o a
través de otras especies reactivas de nitrógeno, los residuos de tirosina en
proteínas, lo cual impide las interacciones funcionales de estos residuos y
pone en peligro la viabilidad celular 204. Dicho efecto ha sido
puesto de manifiesto por nuestro grupo, usando un anticuerpo de alta
especificidad y afinidad para la nitrotirosina en proteínas 28.
Concretamente, se sabe que en la
patogenia de los procesos hipóxicos-isquémicos interviene la liberación de
aminoácidos excitadores (AAE), particularmente la liberación de glutamato que
actúa sobre los receptores NMDA, provocando un aumento del Ca2+ en
las células diana 205-207. La conexión entre la liberación de AAE y
la activación de la vía L-arginina-NO por el aumento del Ca2+
intracelular, que activa la nNOS, es la clave que justifica la hipótesis de que
el incremento excesivo de formación de NO podría ser responsable de la
neurotoxicidad 166,208-211.
Durante la hipoxia/isquemia y
por diferentes mecanismos se produce un aumento en la liberación de especies
reactivas del oxígeno (ERO). Así pues, en situaciones de déficit de O2
el superóxido es producido por la microglía activada 212, el ácido
araquidónico es liberado desde la membrana celular por la fosfolipasa A2 y se
producen colateralmente hidroperóxidos lipídicos y radicales libres. También en
estas circunstancias se da lugar a la entrada de Ca2+, como
consecuencia a la despolarización de membranas, pudiéndose convertir la xantina
deshidrogenasa en oxidasa, para utilizar oxígeno como receptor de electrones y
liberar también el superóxido 213. Como otra fuente de ERO se ha
descrito a la propia NOS, que en concentraciones subóptimas de L-arginina puede
producir el superóxido y el peróxido de hidrógeno 32. Por último, se
admite que la disminución de la actividad de la citocromo c oxidasa de la
cadena respiratoria mitocondrial que se produce tras la isquemia 214
puede llevar a la liberación de ERO. Para todos estos procesos es necesaria la
presencia de oxígeno, lo cual nos lleva a pensar que estos fenómenos se
producirían a partir del período de reperfusión/reoxigenación con un tejido
dañado.
Por lo tanto es lógico pensar
que el aumento de producción de NO y superóxido durante la hipoxia/isquemia
conlleva a un gran incremento en la formación de peroxinitrito. Anteriormente
se ha demostrado que este anión se combina con tioles y ciertas moléculas con
grupos -OH (glucosa, serina, etc.) para formar moléculas que donan NO. Este
mecanismo puede considerarse como un proceso de destoxificación "activa", ya
que las moléculas formadas tienen propiedades citoprotectoras 215,216.
Por eso puede decirse que en aquellas condiciones en las que se produce un
agotamiento de dichas defensas, cual es el caso del estrés oxidativo causado
por la producción excesiva y/o prolongada de sustancias oxidantes, incluido el
propio peroxinitrito, las células quedan expuestas al efecto pernicioso
combinado de estas especies reactivas. Este mecanismo explicaría la aparente
desconexión que encontramos al intentar relacionar, por ejemplo, las acciones
neurotóxicas de los aminoácidos excitadores cuyos canales asociados tienen dinámicas
del orden de milisegundos, con los procesos graduales de degeneración neuronal
y cuya evolución se desarrolla a lo largo de varios años.
Existen evidencias que nos
sugieren que es el peroxinitrito el responsable de los efectos neurotóxicos del
NO 191,203. Sin embargo, se desconocen los mecanismos por los cuales
esta molécula produce la muerte neuronal. Se ha propuesto que su efecto podría
originarse por la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial 154.
Sin embargo, se ha demostrado recientemente que el peroxinitrito de origen
extracelular no afecta a la función mitocondrial, ya que es eficazmente
destoxificado 217-219. Por ello, es importante estudiar los
mecanismos por los cuales el peroxinitrito produce neurotoxicidad, lo que
además permitirá el diseño de estrategias neuroprotectoras, ya no sólo
aumentando las defensas antioxidantes sino también actuando a un nivel más
inferior en la secuencia fisiopatológica. En años anteriores y por separado,
han sido estudiados estos mecanismos, utilizando como modelos biológicos las
plaquetas humanas 215 y por nosotros mismos los macrófagos de ratón
de la serie J774 72. En ambos tipos de trabajo el peroxinitrito
altera el mecanismo de transducción de señales que afectan a la formación de
cAMP y cGMP 215, produciendo depleción extracelular de grupos
sulfhidrilo 220 y aumentando la concentración intraplaquetaria de Ca2+
por su entrada a través de la membrana.
NO/PEROXINITRITO/NITROTIROSINA
Por último, la formación de
nitrotirosina ha sido demostrada en algunos desordenes inflamatorios, lesiones
arterioescleróticas y enfermedades neurodegenerativas 28,178,204,221,222.
Aunque la nitración de proteínas ha sido usada como índice de la producción de
peroxinitrito, también puede ocurrir por otras vía que no implican el
peroxinitrito, por ejemplo la formación de nitril cloruro (NOCl) por la acción
de la mieloperoxidasa en procesos inflamatorios 222.
La nitración de proteínas puede
alterar la conformación y estructura de las proteínas, su actividad catalítica
y o su susceptibilidad para su digestión 223-225. Se ha demostrado
también que la nitración de los anillos de tirosina de las proteínas puede
disminuir la efectividad de las proteínas como substrato de las
tirosina-quinasas 193,225-227. Por ello a través de la expresión de
nitrotirosina de proteínas se puede valorar el efecto tóxico del NO, que participa en la interrupción de los
procesos de señalización celular y que tiene carácter de lesión difícilmente
reversible, aunque se ha descrito recientemente una actividad enzimática
desnitrasa en algunos tejidos 228.
NO/SISTEMA
COMPLEMENTO
Actualmente, se empieza a
conocer que la acción de NO sobre los vasos sanguíneas en los procesos
inflamatorias no es un mecanismo sencillo de vasodilatación, sino algo más
complejo que tiene sus efectos también en los factores del sistema de
complemento (inhibidor de C1, el factor B, el factor H y el C4), así como en
las serina-proteasas, la plasmina y miniplasmina, y tal vez en otros compuestos
que hoy por hoy aún no son conocidos 229. Toda esta activación e
incremento de expresión de los diversos compuestos citados se ha conocido como
partícipe en la secuencia de acontecimientos que se produce durante el
desarrollo de las lesiones cerebrovasculares secundarias a la hipoxia/isquemia-reperfusión/reoxigenación,
demostrándose también que estos mecanismos se ponen en marcha en diferentes
tipos de agresiones que pueden incidir en la normal circulación cerebral 230-235.
En esta línea, Collard y col 236-237
demostraron como se producía, durante la reoxigenación tras la hipoxia sufrida
por las células endoteliales de la vena umbilical humana, la activación y
depósito de las proteínas del complemento, influyendo en la translocación del
factor nuclear κB y la expresión de las moléculas de adhesión celular
vascular y decreciendo el nivel de CGMP dependiente del NO endotelial. Tratando
estas células endoteliales sometidas a hipoxia con el inhibidor recombinante
humano del complemento, se consiguió la atenuación del depósito de las
proteínas del complemento, la translocación del factor nuclear κB y la
expresión de las moléculas de adhesión, preservando la síntesis de CGMP
dependiente de NO e inducido por la acción de la acetilcolina. Todo ello vino a
demostrar como en el periodo de reoxigenación tras la hipoxia las proteínas del
complemento pueden directamente influir sobre el eje NO/CGMP.
Vakeva y Meri 238 han
demostrado que los componentes del complemento C1q, C3c, C3d, C4, C5 y C9 se
depositan durante la anoxia, lo cual indica una activación del sistema
complemento por las células endoteliales. Esta activación puede ser un
mecanismo importante en la patogénesis de las lesiones que se producen en el
SNC tras la hipoxia/reoxigenación. En esta situación Collard y col (1999)
señalan que se inducen la expresión de los receptores de las proteínas del
sistema complemento tipo I (CR1, CD35) en el endotelio vascular humano. Morgan
y col 231 señalaron que el complemento es el responsable de
numerosas patologías en el SNC, interviniendo en este mecanismo varias células
del SNC que sintetizan el complemento y también expresan sus receptores
específicos.
Lindsberg y col 239
señalaron que, en condiciones normales, el parénquima cerebral se encuentra
virtualmente aislado de la acción de diferentes factores inmunológicos y entre
ellos de las proteínas del complemento. No obstante, cuando se produce en un
proceso patológico -isquemia, hemorragia cerebral o subaracnoidea, etc.- una
alteración de la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica se facilita la
extravasación de las proteínas del complemento y con ello el desarrollo de una
inflamación no neurológica que agrava el daño cerebral inicialmente producido.
En este sentido discurren también las investigaciones que llevaron a cabo
Mollnes y Fosse 240.
Resumiendo, en los procesos de
hipoxia/isquemia-reperfusión cerebral se dan lugar los siguientes fenómenos:
- Un aumento de la actividad y
expresión de la eNOS a los pocos minutos de producirse la hipoxia, en un
intento urgente de regular por medio de una vasodilatación el flujo sanguíneo
cerebral 194.
- Un aumento de la actividad y
expresión de la nNOS 25,197,217 que producirá un incremento de NO,
contribuyendo a medio plazo al daño isquémico en el cerebro, que se reduce en
un 40% en ratones "knockout" que carecen genéticamente de nNOS.
- Un aumento de la actividad y
expresión de la isoforma iNOS, que tiene lugar después de varias horas de
iniciarse el estímulo hipóxico, con la producción de niveles incontrolados de
NO, contribuyendo de manera decidida al progreso de la neuropatología 73.
En ratones "knockout" que genéticamente no expresan iNOS el daño cerebral
también está muy reducido 241.
En todos estos trabajos y
modelos previos hemos podido observar una relación directa entre la carencia de
O2 y el aumento de las isoformas nNOS e iNOS, así como con la
formación de nitrotirosina.
NO/ENVEJECIMIENTO
Finalmente es interesante
señalar el papel que desempeña el NO en los procesos de envejecimiento 242,
considerando a este como un proceso multifactorial que afecta de forma
heterogénea a todas las células que conforman los seres vivos, las cuales se
ven sometidas con el paso del tiempo a un deterioro morfofuncional que pueden
conducirlas a la muerte 243,244. Se sabe que las claves que
sostienen este proceso involutivo son tanto de carácter genético como ambiental
245,246, ya que aunque los seres vivos han sido diseñados para
reproducirse y posteriormente extinguirse, no todos ellos lo hacen a por igual 247.
Aunque ya hemos señalado ya el
papel que juegan los radicales libres y particularmente el NO en el daño
celular y tisular que tiene lugar tras procesos de hipoxia-reoxigenación 195,221,248,
también hemos de tener en cuenta que el estrés oxidativo originado por
radicales libres y entre ellos el propio NO 249, se incrementa en
situaciones patológicas como las ya comentadas 250. La presencia de
estas especies reactivas en las células es consustancial con el desarrollo de
sus actividades vitales y particularmente con las derivadas del metabolismo
oxidativo que las células deben realizar de forma continua en las mitocondrias
para generar la energía que necesitan para vivir 251. Si además se
consideran otras fuentes externas, que también pueden generar radicales libres,
se ha estimado que las células reciben diariamente de forma espontánea unos
10.000 impactos oxidativos que dañan moléculas tan importantes como los lípidos
de las membranas, las proteínas enzimáticas y el material genético que las
constituyen 252. Finalmente, las células dañadas irreversiblemente
acaban progresando hacia su muerte, bien a través de mecanismos de necrosis
(que normalmente ocurre durante una patología) o bien a través de los
mecanismos programados de apoptosis (que es la forma fisiológica que tienen los
seres vivos para eliminar células inservibles o transformadas) 253.
Todas estas evidencias han hecho cada vez más consistente la idea de que el
envejecimiento es la consecuencia del daño causado por estas moléculas
altamente reactivas a lo largo del tiempo 28,254-257. Con
posterioridad, las células envejecidas, normalmente inservibles e incluso
potencialmente dañinas para el conjunto del organismo, programan su propia
muerte con las consecuencias que de ello se derivan, en cuanto al deterioro que
se produce en el órgano o tejido en el que están integradas 243.
Entre los radicales libres causantes del daño oxidativo caben destacar el
superóxido, el hidroxilo, el peróxido de hidrógeno, el propio NO y por supuesto
el peroxinitrito 28,242,258,259.
En todos estos mecanismos de
muerte celular desencadenados por radicales libres, el Ca2+ juega un
papel central, ya que un aumento de sus niveles citosólicos lleva a la
activación no sólo de la nNOS y eNOS, como ya se ha comentado, sino también de
otras enzimas como las fosfolipasas, las endonucleasas y las proteasas tipo
caspasas que son responsables de la ejecución del programa de muerte celular 260.
En cualquier caso, las células
presentan sistemas enzimáticos altamente específicos para inactivar las
especies reactivas de oxígeno y reparar los daños que hayan podido inferir a
las células. Entre estos sistemas, que han sido denominados genéricamente como
defensas antiestrés oxidativo, cabe destacar las enzimas superóxido dismutasa
(SOD), glutatión peroxidasa (GSP), glutatión transferasa (GST), glutatión
reductasa (GOR) y catalasa 261. De hecho, los genes que codifican
para estas enzimas así como todos aquellos implicados en regular su expresión o
modificar su función, han sido denominados como gerontogenes por la relación
que guardan con el proceso de envejecimiento 257,262. Así, por
ejemplo, se sabe que los animales más longevos dentro de su especie, presentan
versiones extraordinariamente eficaces de la SOD y otros enzimas detoxificantes
247,263 y que determinadas patologías asociadas a envejecimiento
precoz y patológico presentan déficit de estos sistemas 264.
Creemos pues que con todo lo
anteriormente expuesto se puede justificar perfectamente el que al NO se la
haya considerado como la molécula del año 1992 265 y posteriormente
el motivo de la concesión del premio Nobel compartido entre Furchgott, Ignarro
y Murad en el año 1998, quien llegó a postular sobre esta molécula "que en
campo de la investigación y aplicación del NO sólo estábamos en el principio".
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado
por el Programa COINCIDENTE DN8644, por
la Comunidad de Madrid (0.85/0052.1/1998) y por el Programa Sectorial de
Promoción General del Conocimiento (PM98-0126-c02-01)
Correspondencia:
J. Rodrigo
Dpto. de Neuroanatomía y Biología
Celular. Instituto Cajal (CSIC)
C/Dr. Arce, 37
28002 Madrid
Tfno. 91 5854714
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