Notas informativas/ Resúmenes de Proyectos de Investigación concedidos por el Departamento de Salud

ANALES DEL SISTEMA SANITARIO DE NAVARRA
Notas Informativas




La implicación de la pérdida de heterozigosidad de la región del gen DCC (18q21-23) y la pérdida de expresión inmunohistoquímica de la correspondiente proteína en la malignización del astrocitoma

M.A. Idoate

Departamento de Anatomía Patológica. Clínica Universitaria. Universidad de Navarra. Pamplona


Fundamento. El gen DCC es un probable gen supresor que se localiza en la región cromosómica 18q21-23, cuya proteína funciona como una molécula de adhesión que interviene en el control de la actividad proliferativa y en la invasividad tumoral. Dado que ambos han sido poco estudiados en el astrocitoma, se ha realizado un estudio para la valoración del estado molecular de la región del gen DCC (rDCC), de la proteína correspondiente (pDCC) y de las alteraciones numéricas del cromosoma 18. Se valoró la relación de los parámetros indicados con la actividad proliferativa tumoral.

Material y métodos. Se han estudiado 73 astrocitomas primarios cerebrales, 14 de grado 2 y 59 de alto grado (15 de grado 3 y 44 de grado 4), mediante una metodología combinada: A) Análisis mediante PCR utilizando sondas específicas frente a cinco microsatélites altamente polimórficos (D18S69,-64,-55,-61,-58, Amersham®) de la rDCC y mediante la técnica de FISH para la identificación del cromosoma 18 (sonda frente a satélites alfa pericentroméricos, ONCOR®). Los tumores fueron agrupados de acuerdo al número de microsatélites alterados. B) Estudio inmunohistoquímico de la pDCC (clon, G97-449), que fue valorada como positiva o negativa. C) La actividad proliferativa se estimó mediante el porcentaje de núcleos tumorales inmunorreactivos del antígeno Ki-67 (clon, MIB-1) y citometría (fase S e índice de proliferación). Se establecieron dos subgrupos de glioblastoma, "de novo" y secundario, según datos clínicos y anatomopatológicos. Se correlacionaron los resultados obtenidos con los datos de supervivencia global y tiempo libre de enfermedad. Se aplicaron los tests estadísticos apropiados en cada caso: test paramétricos para las variables cuantitativas, tablas de contingencia (chi-cuadrado) para las variables cualitativas y curvas de supervivencia (log-rank) para la correlación con los parámetros clínicos.

Resultados. La media de edad fue de 60, 40 y 34 años para las series de glioblastoma, astrocitoma anaplásico y astrocitoma de bajo grado respectivamente. Se observó un predominio de hombres (65%) sobre mujeres (34%). La localización más frecuente del tumor fue en el lóbulo frontal (35%). Se identificó pérdida de heterozigosidad (LOH) e inestabilidad de microsatélites (IM) de la rDCC que se distribuyeron como (Fig. 1):

a) Astrocitomas grado 2: informatividad, 70%; no deleción, 74%; LOH de una sonda, 26%; LOH >2 sondas, 0%.

b) Astrocitomas grado 3: informatividad, 81-86,7%; no deleción, 56%; LOH de una sonda, 25%; LOH >2 sondas, 19%.

c) Astrocitomas grado 4: informatividad 68-85,2%; no deleción 56%; LOH de una sonda 35%; LOH >2 sondas, 9%.

No se apreció asociación con el subtipo de glioblastoma (p>0,05). En todos los grados histológicos de astrocitoma se observó que la LOH+IM se originaba más frecuentemente en la porción distal de la rDCC según un patrón intersticial. Se apreció inmunonegatividad para la pDCC, que se distribuyó en: grado 2, 0%; grado 3, 47% y grado 4, 27%. La inmunonegatividad se asoció especialmente al glioblastoma secundario (70% en los primarios versus 18% en los secundarios) y fue estadísticamente significativa (p=0,03). No se observó correlación estadística entre la expresión de la proteína y la LOH+IM de la rDCC (p=0,8) (Tabla 1). Tampoco se apreció significación estadística entre la inmunonegatividad para la pDCC y la deleción del gen (p>0,05). La distribución de resultados del FISH fue disomía (56%), polisomía (40%) y monosomía (5%). La monosomía sólo se detectó en los astrocitomas de alto grado. Se obtuvo seguimiento de un total de 34 astrocitomas de alto grado y de 12 de bajo grado. El periodo máximo de seguimiento fue de 23 meses para los pacientes de alto grado y de 60 para los de bajo grado. No se apreció correlación entre la LOH+IM de la rDCC y la expresión de la proteína con los índices de proliferación del antígeno Ki-67 o citométrico (p>0,05). Se ha encontrado correlación entre inmunonegatividad versus inmunopositividad de la pDCC en el conjunto de los astrocitomas (log-rank, p=0,02), pero no en los astrocitomas de alto grado (log-rank, p>0,05). Sin embargo, no se ha encontrado que la LOH de la rDCC tenga correlación con la supervivencia total para el conjunto de pacientes con astrocitomas o con los pacientes afectos de astrocitomas de alto grado (log-rank, p>0,05).

Conclusiones. La LOH e IM de la región del gen DCC y la inmunonegatividad para la correspondiente proteína están implicados en la malignización de los astrocitomas y en el desarrollo de los glioblastomas. La inmunonegatividad para la proteína dcc se asocia especialmente al glioblastoma secundario. Ni la LOH de la región del gen DCC ni la pérdida de expresión inmunohistoquímica de la proteína mostraron tener significado pronóstico. La valoración de la inmunorreactividad para la pDCC puede ser útil en el diagnostico diferencial entre los astrocitomas de grados 2 y 3.

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Síntesis visual del habla

R. Cabeza

Departamento de Ingeniería Eléctrica y Electrónica. Universidad Pública de Navarra


Fundamento. En ciertas afecciones neurológicas degenerativas, así como en ciertos traumatismos graves del sistema nervioso central, la capacidad de movimientos se ve reducida hasta límites impensables, llegando incluso a la pérdida del habla, manteniendo sin embargo intactas las capacidades cognitivas. Por ello, este tipo de pacientes no poseen en la actualidad un mecanismo de comunicación con su entorno adaptado a sus necesidades, debido principalmente a la extrema dificultad que se deriva de la práctica inexistencia de mecanismos de control por parte del paciente.

Este proyecto de investigación se centra en el diseño y desarrollo de un sistema integrado para la comunicación, bien sea a través de la palabra o con los elementos de su entorno, de personas con severas limitaciones en su movilidad. El mecanismo de control usado es la localización de la mirada del paciente en una pantalla. Este mecanismo de entrada es bastante universal ya que en la mayoría de los casos se conserva intacto el control sobre el movimiento ocular. No obstante, el sistema admite también la entrada por otros dispositivos genéricos que complementen la variable de control principal que es la mirada.

Los objetivos planteados para el proyecto consisten en la realización de un sistema de síntesis de habla controlado por la mirada del sujeto. Este objetivo general se desglosa en tres submódulos:

- Módulo de seguimiento de la mirada. Se pretende con este módulo el seguimiento en tiempo real de la mirada del usuario sobre la pantalla de un ordenador. Deberá tener la capacidad de ser insensible a ligeros movimientos de la cabeza, así como a variaciones suaves en la iluminación ambiente.

- Módulo de interfaz. La finalidad de este submódulo consiste en la realización de un programa informático para la construcción de las frases a sintetizar. Deberá ser un programa "inteligente" de tal forma que facilite al máximo dicha tarea para minimizar el tiempo muerto entre frase y frase y optimizar el uso de la superficie del monitor en función de la resolución obtenida por el primer módulo. - Módulo de síntesis. El último módulo consiste en la síntesis de la voz a partir del texto construido. Una característica fundamental es la calidad de dicha síntesis con mejoras en los campos de la entonación y prosodia.

Material y métodos. Agrupados en los tres módulos citados, los materiales y métodos utilizados han sido los siguientes:

- Módulo de seguimiento de la mirada. Para este apartado el material necesario ha consistido, de forma genérica, en una cámara de vídeo con alta sensibilidad al infrarrojo, una lente zoom, una tarjeta digitalizadora de vídeo así como la correspondiente iluminación infrarroja. Los métodos usados han consistido básicamente en algoritmos de procesado de imagen, siendo los más importantes y críticos las umbralizaciones de las imágenes adquiridas. Cabe destacar la necesidad de realizar un proceso de calibrado previo a la utilización del sistema para poder asignar de forma precisa el punto de la pantalla al cual se está mirando.

- Módulo de interfaz. Respecto de este segundo módulo, el material necesario ha sido la pantalla de cristal líquido de 19", con vistas a poseer una máxima área de representación, así como un entorno de desarrollo estable como es la versión 4 de Borland Builder. Los métodos utilizados han sido la programación orientada a objetos así como la implementación del concepto de interfaz adaptativa, de tal forma que el sistema va acomodándose a las preferencias y uso del paciente. Como punto esencial a resolver está el denominado Midas Touch, para lo cual se han desarrollado tres tipos de interfaz en función del método de selección: por tiempos, por zonas o por dispositivo externo.

- Módulo de síntesis. En este caso el material utilizado ha sido de nuevo el entorno de programación Borland Builder, así como las base de datos de difonemas tanto en castellano como en euskera. Los métodos consisten principalmente en la aplicación del algoritmo de concatenación que se denomina TD-PSOLA (Time Domain Pitch Synchronous Overlap Add), así como las variaciones pertinentes del mismo para obtener mejores resultados a la hora de aumentar la naturalidad de la voz sintetizada por medio de la expresión de estados de ánimo, enfatización de palabras, patrones de entonación, etc.

Lógicamente todos estas herramientas necesitan un elemento común, como es un ordenador compatible con suficiente capacidad de proceso para garantizar en todo momento la posibilidad de realizar el procesado de las imágenes procedentes del primer módulo, sin desatender las tareas de los otros dos módulos restantes.

Resultados y Discusión. Los objetivos iniciales hasta ahora expuestos se han cumplido perfectamente. La mejor demostración de ello es el hecho de que en la actualidad el sistema está funcionando con un paciente real con unos resultados altamente prometedores. Éstos indican de forma inequívoca la viabilidad del método utilizado para el seguimiento de la mirada del paciente, tanto por su versatilidad, comodidad y precisión. Respecto del módulo de interfaz, ha solventado perfectamente los requerimientos iniciales de modularidad y adaptabilidad. Se ha demostrado en la práctica que la interfaz más eficiente es aquella que usa zonas de selección. No obstante, dicha experiencia ha obligado a multitud de cambios en el diseño de la interfaz, que no han comportado un excesivo trabajo extra debido a que uno de los principios básicos a la hora de diseñar la interfaz, era su facilidad de cambio. Por último, en el campo de la síntesis se han obtenido unos resultados más que satisfactorios, obteniéndose unas mejoras notables en la naturalidad de la voz sintética, a través del control de los diferentes patrones entonativos, énfasis, volumen, etc.

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Estudio del sistema fibrinolítico en la trombofilia hereditaria: papel del TAFI

J.A. Páramo

Departamento de Hematología. Clínica Universitaria. Universidad de Navarra. Pamplona


Fundamento. Recientemente se ha descrito que la trombina activa a una molécula que es capaz de eliminar los residuos de lisina de la superficie de la fibrina, ralentizando así la activación del plasminógeno a plasmina. A dicha molécula se la ha llamado TAFI (inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina). Existen indicios que apuntan a que el TAFI podría jugar un papel protrombótico relevante en las condiciones en las que se generen cantidades anormalmente altas de trombina, pero este hecho no ha sido demostrado de modo concluyente. El objetivo de este trabajo ha sido analizar el papel del TAFI en el mecanismo fisiopatológico de dos mutaciones, el polimorfismo G20210A del gen de la protrombina (G20210A) y el factor V Leiden (FV Leiden), que constituyen factor de riesgo de tromboembolismo venoso (TEV) y que se asocian con un potencial procoagulante anormalmente elevado. Asimismo, se ha pretendido estudiar otros parámetros fibrinolíticos en relación con las citadas anomalías genéticas, para obtener una visión más global del mecanismo fibrinolítico en los portadores de G20210A y de FV Leiden.

Material y métodos. Se estudiaron 60 sujetos, de los cuales 30 habían padecido al menos un episodio de TEV y 30 no tenían antecedentes de la citada patología. De los 60 individuos, 20 presentaban la mutación G20210A, 10 el FV Leiden, y 30 ninguna de las dos mutaciones.

Se realizaron las siguientes determinaciones:

- Actividad TAFI en plasma, mediante una cinética TAFI-dependiente de formación y lisis de coágulo, en presencia y ausencia de un inhibidor del TAFI activo.

- Nivel antigénico (TAFI total) en plasma (ELISA).

- PAI funcional en plasma (sustratos cromogénicos).

- t-PA funcional en plasma (sustratos cromogénicos) antes y después de someter al individuo a una condición de estrés endotelial (test de oclusión venosa).

- Factor II coagulante (FII:c) [técnica coagulante].

- Dímero D (DD) [ELISA].

- Fragmento 1+2 de la protrombina (F1+2) [ELISA].

- Complejos trombina-antitrombina (TAT) [ELISA].

Resultados. No se detectaron diferencias en la actividad TAFI entre portadores de ambas mutaciones y no portadores, independientemente de la presencia o ausencia de historia de TEV. Sin embargo, sí se detectó una correlación estadísticamente significativa de la actividad TAFI con la actividad PAI plasmática, con el FII:c y con el F1+2. Se observó que el nivel antigénico de TAFI era inferior en los portadores de FV Leiden respecto a los no portadores, tanto entre los sujetos sanos como en los pacientes con historia de TEV.

Dentro de los sujetos libres de historia de TEV, tanto los portadores de G20210A como los de FV Leiden presentaron niveles de actividad PAI plasmática significativamente mayores que los obtenidos en los pacientes no portadores, hecho que impidió técnicamente comprobar si la liberación endotelial de t-PA, tras la exposición a una situación de estrés (test de oclusión venosa), variaba según se fuera o no portador de alguna de las dos anomalías genéticas.

Discusión. La actividad TAFI plasmática no parece estar significativamente aumentada en los sujetos portadores de G20210A o de FV Leiden, independientemente de que presenten o no historia de TEV. Sin embargo, el hecho de haber encontrado que la actividad TAFI correlaciona positivamente tanto con los niveles de FII:c como con el F1+2, marcadores ambos de potencial procoagulante, nos hace creer que el TAFI jugará un papel protrombótico adicional durante el estado de hipercoagulabilidad, situación en la que la generación de trombina se ve anormalmente incrementada. El dato de un menor nivel antigénico de TAFI en los portadores de FV Leiden debe interpretarse de momento con mucha precaución, puesto que el tamaño muestral donde se estudió esta variable era bastante reducido. El otro hecho reseñable es que, dentro de los sujetos sin historia de TEV, la actividad PAI plasmática es significativamente mayor en los portadores de G20210A o de FV Leiden respecto a los no portadores, lo cual podría constituir un mecanismo fisiopatológico adicional por el que ambos polimorfismos contribuirían a incrementar el riesgo de TEV.

Por lo tanto, se debe continuar profundizando en el estudio del papel del TAFI en la trombofilia hereditaria y, por extensión, en cualquier situación que conduzca al estado hipercoagulable. Asimismo, se debe analizar más detenidamente el posible protagonismo del PAI-1 en la trombofilia hereditaria, al menos en relación con la mutación G20210A de la protrombina y con el factor V Leiden.

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Valoración de la biocompatibilidad de diferentes membranas de hemodiálisis mediante el estudio de factores hemostáticos relacionados con la función endotelial, en pacientes con Insuficiencia Renal Crónica en programa de diálisis.

M.L. Álvarez, A. Purroy

Servicio de Nefrología. Clínica Universitaria. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra


Fundamento. La hemodiálisis (HD) ha supuesto un avance muy importante en el tratamiento de los enfermos con Insuficiencia Renal Crónica (IRC). Sin embargo, es una técnica no exenta de posibles complicaciones. Una de ellas se deriva del contacto de la sangre del paciente con una serie de materiales extraños al organismo (los del circuito extracorpóreo) que pueden desencadenar diversas reacciones adversas que se conocen como fenómenos de bioincompatibilidad. Son reacciones que constituyen verdaderas respuestas inflamatorias y que se describieron ya en 1968 al comprobar que, en los primeros minutos de la HD, se producía una leucopenia que se recuperaba posteriormente.

El contacto de la sangre con el material de diálisis (el más significativo es el filtro de diálisis tanto por la composición de la membrana como por su estructura y por el método de esterilización empleado) puede dar lugar a la activación de sistemas proteicos y celulares. El más estudiado ha sido la activación del complemento, que da lugar a agentes proinflamatorios que pueden ejercer su acción de forma directa o mediante la activación de los leucocitos. Esta activación del complemento, guarda relación con el grado de biocompatibilidad de las membranas que a su vez se relaciona con la composición de las mismas. Así, las membranas celulósicas se acompañan de un incremento de la actividad fibrinolítica a través de la liberación endotelial del activador tisular del plasminógeno (t-PA).

Se ha descrito asimismo una activación monocitaria con liberación tanto de interleuquinas como del factor de necrosis tumoral. Por otra parte, la interacción de las plaquetas con las membranas de diálisis induce la formación de microagregados con la consiguiente liberación de trombomodulina y tromboxano. Quizás se puede afirmar que a través de la activación del complemento y de la generación de interleuquinas, se han podido explicar la mayor parte de los fenómenos adversos aceptados actualmente como dependientes de la biocompatibilidad.

Un hecho significativo en los enfermos en tratamiento crónico de diálisis es el daño vascular a través de una arteriosclerosis acelerada. Múltiples factores de riesgo cardiovascular están implicados en estos pacientes. Algunos de ellos son superponibles a los de la población general, mientras que otros son más específicos de esta población como puede ser la dislipemia asociada a la diálisis, la mayor prevalencia de hipertensión arterial, el hiperparatiroidismo, el incremento del fibrinógeno, la hiperhomocisteinemia, las alteraciones hemostásicas, la anemia... Todos ellos están implicados en la patogenia de la enfermedad vascular arterioesclerótica que es un proceso inflamatorio en el que la lesión inicial del endotelio vascular es fundamental para su desarrollo.

En relación con ello parece muy importante estudiar el comportamiento del endotelio y por tanto incluirlo entre las posibles consecuencias de la bioincompatibilidad. Se requiere disponer de procedimientos capaces de detectar cambios en la función endotelial. En este sentido se ha propuesto la medición de substancias solubles de origen endotelial como el factor von Willebrand (FvW), la trombomodulina (TM), el activador tisular del plasminógeno (t-PA), y el inhibidor del activador tisular del plasminógeno (PAI-1).

Son varios los datos que indican que en la uremia existe un estado de lesión crónica del endotelio. Así lo reflejan los niveles séricos elevados de factores de origen endotelial como la trombomodulina o el factor von Willebrand, y la disfunción del sistema fibrinolítico objetivado a través de sus componentes principales como el activador tisular del plasminógeno (t-PA) y el inhibidor del activador tisular del plasminógeno (PAI-1) de origen también endotelial. Existe la posibilidad de que junto a los factores de riesgo cardiovascular mencionados más arriba, la hemodiálisis intervenga en todo este proceso lesivo del endotelio a través de todas las reacciones derivadas de la bioincompatibilidad del circuito extracorpóreo. De hecho algunos estudios han objetivado un estado de disfunción del endotelio y un aumento de algunos factores de daño endotelial durante la hemodiálisis.

El objetivo del trabajo ha sido valorar el efecto agudo de diferentes dializadores sobre diversos marcadores de daño endotelial y de esta manera estudiar otro aspecto de la biocompatibilidad de las membranas de HD.

Material y métodos. Se incluyeron 21 pacientes (11 varones y 10 mujeres) en tratamiento crónico de hemodiálisis. La edad media era de 60 años y el tiempo medio en el programa de diálisis de 57 meses. Los enfermos fueron divididos en tres grupos y cada grupo fue asignado al azar a cada uno de los tres tipos de filtros utilizados: Polisulfona de baja permeabilidad esterilizado con óxido de etileno (PE), Polisulfona de baja permeabilidad esterilizado con vapor (PV) y Cuprophan esterilizado con óxido de etileno (CE). Cada enfermo se realizó una sesión de HD con cada uno de estos filtros (en el orden resultante siguiendo un diseño de "cuadro latino"), existiendo una semana de intervalo entre cada sesión motivo de estudio.

Las sesiones de HD tuvieron una duración de tres horas y se realizaron siguiendo la pauta habitual (heparina de bajo peso molecular, QB de 250-300 ml/min, solución de diálisis de bicarbonato y ajustando las pérdidas de acuerdo con el peso seco de los pacientes).

Las determinaciones analíticas realizadas, aparte de las habituales en una unidad de diálisis, fueron: factor von Willebrand, Trombomodulina, t-PA antigénico, PAI-1 funcional, y PAI-1 antigénico siguiendo las técnicas validadas del laboratorio de hematología.

El estudio estadístico se realizó mediante un diseño factorial mixto de medidas repetidas en el que intervienen factores inter-sujetos (orden) e intrasujetos (filtros y periodos) (Anova multivariante o "Manova"), con la aplicación a "posteriori" del test de comparaciones múltiples de Duncan.

Resultados y discusión. En los resultados obtenidos (Tabla 1) se aprecia un incremento significativo del fvW al final de la sesión de diálisis cuando se utilizan los filtros de PE y de CE con respecto a cuando se utilizan los filtros de PV. El incremento es mayor con los filtros de CE que con los filtros de PE y de estos que con los filtros de PV por lo que es posible que el incremento sea consecuencia tanto de la composición del filtro como del esterilizante. Aunque se ha descrito una elevación de la trombomodulina cuando se utiliza una membrana celulósica (Cuprophan), en el presente trabajo sólo se produce un incremento a los 60' de iniciada la sesión de diálisis para recuperar al final los valores basales. Es posible que la determinación a los 20 minutos (momento de máxima activación de los principales sistemas proteicos y celulares) hubiese puesto de manifiesto un incremento significativo de la trombomodulina. Es a los 20 minutos cuando se ha descrito un mayor incremento de la IL-1, del TNF-alfa y de la trombina. Este aumento de la trombina podría ser la causa de la elevación de la trombomodulina.

El t-PA, componente del sistema fibrinolítico, presenta un aumento significativo a los 20 minutos de iniciada la sesión de diálisis cuando se utiliza el filtro de CE aunque posteriormente se recuperan los valores basales. De nuevo hay que considerar el efecto del Cuprophan en los primeros minutos de la diálisis con la activación del complemento, de la coagulación y del factor activador de las plaquetas que son sistemas que favorecen la liberación del t-PA. En conjunto el t-PA tiende a incrementarse a lo largo de la diálisis. Sin embargo, el PAI-1 tiende a disminuir a lo largo de la sesión con los tres tipos de filtros de tal manera que el t-PA y el PAI-1 parecen tener un comportamiento de imagen en espejo. En los cambios descritos hay que considerar no sólo el efecto de la producción endotelial de estos factores, sino el posible efecto de la propia diálisis sobre ellos tanto a través de una posible filtración (poco probable) como de una más probable adsorción por parte de las membranas de diálisis. Sin embargo, no hay datos en la literatura que permitan conocer el grado de adsorción.

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Valoración inmunohistoquímica de la expresión de c-erb B2 en carcinoma mamario estadio II patológico con ganglios positivos y su importancia como factor pronóstico en la aparición de metástasis

F. Vicente1, J.M. Martínez-Peñuela2, C. Miranda1, C. Valenti2, S. Montón1, L. Blázquez1

1. Servicio de Cirugía General y Digestiva
2. Servicio de Anatomía Patológica. Hospital de Navarra


Introducción. El carcinoma mamario es la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres de los países desarrollados. La incidencia de la enfermedad varía entre distintos países, oscilando entre 11 y 80 casos por 100.000 mujeres/año y en Navarra se estima que la incidencia (tasa estandarizada) de la enfermedad se sitúa en 60,8 casos/100.000 mujeres/año. Durante años se ha intentado encontrar factores que orientaran sobre la evolución de estos tumores, siendo reconocido que los de mayor significación pronóstica hasta el desarrollo de técnicas de inmunohistoquímica, para la determinación de alguno de ellos, ha posibilitado la realización de trabajos retrospectivos que nos permitan valorar su utilidad como factores pronósticos. Diversos trabajos de investigación relacionan la sobreexpresión de c-erb B2 con factores pronósticos como la afectación ganglionar axilar, la supervivencia o el intervalo libre de enfermedad. El objeto de nuestro trabajo es determinar si la determinación de c-erb B2 es un factor pronóstico independiente en el grupo de pacientes seleccionados.

Materiales y métodos. Hemos estudiado, retrospectivamente, 83 pacientes intervenidas entre 1980 y 1990 de carcinoma ductal infiltrante de mama con un tamaño tumoral patológico comprendido entre 2 y 5 cm, presentado todos los casos afectación axilar (estadio II patológico -T2N1-). Hemos obtenido los datos clínicos evolutivos (intervalo libre de enfermedad -ILE-, éxitus y supervivencia) así como los datos diagnósticos (tamaño tumoral, afectación ganglionar, grado histológico y receptores hormonales) de las historias de las pacientes. La determinación de la expresión de c-erb B2 se ha realizado utilizando el kit SUPER SENSITIVE IMMUNODETECTION SYSTEM de Biogenex, mediante un sistema de detección de peroxidasa conjugada con biotina-estreptavidina.

Para el estudio estadístico de los datos obtenidos hemos utilizado el método de las tablas de contingencia Chi cuadrado para variables cualitativas y la t de Student y análisis de la varianza para variables cuantitativas.

Resultados. La edad media de las pacientes estudiadas ha sido 56 años, la media de adenopatías metastásicas de 4, oscilando la afectación entre 1 y 14 (ds. 2,98), la lesión fue grado II en el 61% de los casos estudiados, grado III en el 25% de casos y grado I en el 14%. El 35% de los pacientes mostraron sobreexpresión presentando el 13% 1+, el 13% 2+ y el 8% 3+. Del total de pacientes estudiadas, 40 (48%), presentaron progresión de la enfermedad en el periodo de estudio, falleciendo 32 mujeres durante este periodo a causa de la enfermedad; dos pacientes fallecieron sin progresión de la enfermedad tras 80 y 180 meses de evolución y 41 permanecían libres de enfermedad al cierre del estudio. No hemos encontrado diferencias significativas al comparar los resultados en relación con la edad de las pacientes (p=0,1025), tamaño patológico (p=0,8986), ganglios afectados (p=0,5133). En las pacientes con progresión de la enfermedad no hemos encontrado diferencias en cuanto al intervalo libre de enfermedad (ILE) en relación con la sobreexpresión de c-erb B2 (p=0,8108). Hemos encontrado una relación inversa estadísticamente significativa entre c-34b B2 y receptores estrogénicos (p=0,0403) y no así con los de progesterona (p=0,0668).

Conclusiones. El c-erb B2 determinado mediante inmunohistoquímica sobre cortes de parafina, no es un factor independiente de pronóstico tumoral en tumores ductales infiltrantes de mama T2N1. Existe una tendencia a mayor positividad de c-erb B2 con mayor grado histológico aunque sin significación estadística. No hay relación entre la expresión de c-erb B2 y la edad de presentación, tamaño del tumor, y evolución de la enfermedad en el grupo estudiado. Los receptores estrogénicos presenta una relación inversa con c-erb B2 con significación estadística.

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Escape inmunológico y angiogénesis del melanoma cutáneo

P. Redondo1, A. Bauza1, T. Solano1, M. Idoate2

1. Departamento de Dermatología.
2. Departamento de Anatomía Patológica. Clínica Universitaria de Navarra. Pamplona


Fundamento. En la progresión de un melanoma a una fase invasiva de crecimiento vertical, intervienen factores sólo parcialmente conocidos. Por una parte la generación de nuevos vasos, estimulados por citocinas secretadas por las células tumorales, y por otra, la incapacidad del sistema inmune del huésped para defenderse de la proliferación de células malignas hacen que la enfermedad progrese. Entre las citocinas proangiogénicas están el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) secretadas directamente por las células de melanoma o por el microambiente que se crea a su alrededor. La disminución en la respuesta inmune del huésped puede estar mediada parcialmente, entre otras muchas causas, por la expresión en la superficie de las células tumorales de moléculas de Fas-L a la vez que pierden la expresión de moléculas de Fas, eventos que hacen del melanoma un tejido privilegiado inmunológicamente hablando. Asimismo, la síntesis específica aumentada de factores inhibidores solubles, como el factor transformante de crecimiento beta 2 (TGF-b2) y la interleucina-10 (IL-10) pueden favorecer el escape inmunológico del tumor al reducir la respuesta inmune del huésped.

Material y métodos. En este trabajo se realiza el estudio mediante inmunohistoquímica de 42 melanomas primarios (26 no metastásicos, con un seguimiento mínimo de 5 años, y 16 metastásicos) y 9 metástasis cutáneas de melanoma, valorando la expresión de VEGF, bFGF, Fas y Fas-L. Se miden niveles plasmáticos de estas mismas citocinas y receptores de membrana, junto a IL-10 y TGF-b2, en otros 43 pacientes distintos afectos de melanoma cutáneo en diferentes estadios de la enfermedad.

Finalmente, se realiza un estudio de melanoma en un modelo animal utilizando los ratones C57 y la línea tumoral B16F10. Una vez obtenidas curvas uniformes de crecimiento tumoral, se determinan las concentraciones plasmáticas de varias citocinas, -resultando únicamente reseñables las de VEGF y el factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos (GMCSF)-, tanto en animales control como con melanoma subcutáneo. En estos últimos se realiza tratamiento con dos fármacos -N-acetilcisteína y pentoxifilina- para valorar su posible acción antiangiogénica e inmunomoduladora, así como mediante crioterapia.

Resultados y conclusiones. En relación al estudio de inmunohistoquímica (Tabla 1), podemos concluir que: - las células para adquirir un fenotipo invasivo aumentan la síntesis de VEGF, mientras que las metástasis pueden perder la capacidad de secretar el VEGF y el bFGF.

- la ausencia de Fas y VEGF en la mayoría de los melanomas gruesos con buena evolución detectados en este trabajo, al igual que en los melanomas in situ, podría considerarse como un factor de buen pronóstico, aunque debería valorarse en series más amplias.

Respecto a los valores de citocinas plasmáticas o receptores solubles cabe destacar que:

- La presencia de niveles de FAS soluble aumentaron en melanoma metastásico hasta valores nunca antes referidos (p=0,01).

- Los niveles de bFGF y VEGF en pacientes con melanoma en estadios III y IV fueron el doble que los de los pacientes control (p<0,01 y p=0,021, respectivamente). Los niveles de IL-10 en pacientes con melanoma en estadio III y IV fueron 2 ó 2,5 veces respectivamente más elevados que los de los pacientes control (p<0,01).

- A mayor IL-10 menor VEGF, y a mayor VEGF menor IL-10, encontrándose diferencias estadísticamente significativas al considerar los valores extremos de ambas citocinas. También en el grupo de pacientes con niveles elevados de VEGF se apreciaron valores elevados de TGF-b2, de lo que podría deducirse que esta última es también una citocina proangiogénica cuyos valores pueden ir parejos a los de VEGF, y que también pueden ser inhibidos por la IL-10.

Finalmente, respecto al modelo animal, considerar:

- la N-acetilcisteina in vivo no disminuye -como ocurre en estudios in vitro- sino más bien al contrario, aumenta los niveles plasmásticos de VEGF.

- el posible papel inmunomodulador de la crioterapia aplicada sobre el melanoma, incrementando los niveles plasmáticos de GMCSF.

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Optimización de un medio experimental para la diferenciación de aislamientos de baja virulencia de Salmonella enteritidis

C. Gamazo, M.A. Bonafonte, C. Solano, M. Álvarez, B. Goñi, I. García-Jalón, B. Sesma

Departamento de Microbiología. Universidad de Navarra. Laboratorio del Ayuntamiento de Pamplona. Instituto de Salud Pública de Navarra.


Fundamento. El serotipo Salmonella enteritidis, junto con S. typhimurium, es el que más frecuentemente se aísla en los casos de salmonelosis registrados en Navarra. Resultados obtenidos anteriormente en nuestros laboratorios demostraron que las cepas más virulentas de S. enteritidis cuando se incuban en un medio glucosado deficiente en elementos esenciales (ATM) secretan una matriz polisacarídica extracelular sustentadora de un biofilm. En este trabajo nos planteamos el estudio de los factores fisiológicos y metabólicos implicados en la expresión de dicho biofilm con objeto de optimizar el método de detección del mismo.

Material y métodos. Para la inducción de biofilm en ATM se utilizaron como inóculos células en fase estacionaria o logarítmica.

Las bacterias se resuspendieron en 4 ml de ATM (Adherence Test Medium, medio deficiente en elementos esenciales: 60 mM NaCl, 30 mM NaHCO3, 20 mM KCl, 111 mM glucosa, pH 8,4, en el que las cepas más virulentas de S. enteritidis producen biofilm), se ajustó la DO590nm a 0,4 (6 x 108 UFC/ml, aproximadamente), se incubaron en tubos de borosilicato a 37 ºC en agitación constante (200 rpm) durante 4 horas.

Resultados

Influencia de la glucosa en la etapa de preincubación

La formación de biofilm fue directamente dependiente de la concentración de glucosa en el medio de cultivo durante la preincubación. La expresión del biofilm fue máxima a una concentración de glucosa del 2%, siendo constante a concentraciones superiores (Fig. 1). Posteriormente, se estudió si durante dicha preincubación las bacterias eran capaces de almacenar intracelularmente la glucosa del medio de cultivo como material de reserva (PSI, polisacárido intracelular) para su posterior utilización en la formación del biofilm. Para ello, células completas liofilizadas se trataron con yodo, determinando espectrofotométricamente la cantidad del complejo yodo-PSI formado. Se observó que la síntesis de PSI fue dependiente tanto de la concentración de glucosa en el medio de cultivo como de la fase de crecimiento. Las células procedentes de fase exponencial apenas acumularon PSI. Por el contrario, las células procedentes de fase estacionaria acumularon mayor cantidad de PSI conforme mayor era la concentración de glucosa en el medio de cultivo, hasta un máximo del 2%. En conformidad con estos resultados, la mínima concentración de glucosa necesaria en el ATM para formar el biofilm fue mayor en los cultivos procedentes de fase exponencial (0,75 mg/ml) que de fase estacionaria (0,25 mg/ml).

La observación de las bacterias mediante microscopía óptica tras realizar la tinción de peryodato-Schiff, tinción específica de polisacáridos como el glucógeno, reveló la presencia de unos gránulos refringentes en los polos de las bacterias. La observación de las bacterias al microscopio electrónico confirmó la existencia de gránulos de glucógeno. Además, dichos gránulos eran más numerosos en las bacterias en fase estacionaria que en exponencial. Estos gránulos estaban dispersos por el citoplasma. Sin embargo, cuando las células procedían de cultivos en TSA 2% glucosa, los gránulos se aglomeraban en los polos de la bacteria (Fig. 2).

A partir de estas observaciones se estudió la relación entre la formación del biofilm y las reservas de polisacárido intracelular, estudiando el efecto de reguladores de las vías metabólicas del glucógeno. El sitio de regulación alostérica en la síntesis bacteriana de glucógeno es a nivel de la enzima ADP-glucosa pirofosforilasa. Por ello, se utilizó como activador de la glucogenogénesis la fructosa-1,6-difosfato (0,5 mM). Las bacterias procedentes de TSA, si se incubaban en ATM con fructosa-1,6-difosfato, incrementaban considerablemente la formación del biofilm respecto de las incubadas en ATM; asimismo, se incrementó la síntesis de glucógeno (0,110 mg/mg de peso húmedo de células) respecto del control sin activador (0,047 mg/mg).

Finalmente, se cuantificó la virulencia de una cepa clínica de alta virulencia, incubada en TSA, TSA con 2% glucosa y TSA con 8% glucosa (DL50 en el modelo de pollo recién nacido, infección intraperitoneal). Los resultados demostraron que la virulencia se incrementaba proporcionalmente a la cantidad de PSI acumulado 1,79 (TSA); 0,48 (TSA 2% glucosa); 0,63 (TSA 8% glucosa). Paralelamente, se realizó el mismo estudio con una la cepa de baja virulencia, no observándose variaciones de la virulencia (DL50 5,29).

Estudio de la correlación entre el lugar de aislamiento de la cepa con la virulencia

Con objeto de estudiar si existía correlación entre la virulencia y el origen de la cepas, se analizaron 27 cepas de S. enteritidis de distintos grupos de aislamiento, determinándose su virulencia en pollo y su capacidad de producir biofilm en ATM. Se aislaron cuatro cepas de baja virulencia, tres del río Arga y la otra cepa fue aislada de una crema no implicada en toxinfecciones. Todas las cepas clínicas quedaron incluidas dentro del grupo de alta virulencia.

Dada la correlación entre virulencia y formación de biofilm en ATM, se amplió el estudio a un total de 216 cepas de S. enteritidis (la distribución según el origen se indica en la tabla). Del total, únicamente el 0,5% de las cepas fueron biofilm negativas; sin embargo, si atendemos al origen de la cepa, el 19,5% de las aisladas en el ambiente fueron negativas, así como el 11,5% de las de origen alimentario. Por el contrario, ninguna de las cepas aisladas de animales o del hombre fue biofilm negativa. Es muy posible que la selección a favor de las cepas más virulentas, y por lo tanto poseedoras de unos mecanismos de respuesta adecuados, se produzca en el huésped como resultado de su interacción frente al sistema inmunitario de defensa; pero también pudiera ser que esta selección se produjera ya en el alimento, durante su procesamiento a altas temperaturas o en condiciones ácidas.

Conclusiones. Con objeto de optimizar la formación del biofilm con fines de diagnóstico, proponemos incubar las bacterias en TSA con un 2% de glucosa y añadir el activador de la síntesis de glucógeno fructosa-1,6-diP (0,5 mM) al ATM. Se detectaron cepas de S. enteritidis de baja virulencia en muestras ambientales y de alimentos, y ninguna en muestras de animales (incluido el hombre).

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Fuerza máxima y potencia, resistencia aeróbica, área de la sección transversal muscular y hormonas séricas en hombres de 40 y 65 años

M. Izquierdo1, K. Häkkinen2, A. Antón1, M. Garrues1, J. Ibáñez1, J.L. Larrión3, M. Ruesta1, E.M. Gorostiaga1

1. Centro de Investigación y Medicina del Deporte de Navarra. Gobierno de Navarra. Pamplona
2. Neuromuscular Research Center. Department of Biology of Physical Activity. University of Jyväskylä. Finland
3. Servicio de Geriatría. Hospital de Navarra. Pamplona


Fundamento. La capacidad funcional del sistema neuromuscular, cardiovascular y respiratorio disminuye con el envejecimiento una media por año del 0,5% y 3,5% y se asocia con una reducción de la producción de fuerza máxima/explosiva y de la potencia aeróbica máxima (VO2máx). El deterioro con la edad en la producción de fuerza máxima y explosiva está relacionada en parte con la atrofia muscular y/o pérdida selectiva especialmente de las fibras tipo II y el aumento del tejido graso/conectivo. Asimismo, la activación neural voluntaria de los músculos agonistas y/o cambios en el grado de coactivación agonista/antagonista pueden también diferir en relación con la edad y depender del tipo de acción muscular, la complejidad del movimiento y las características de velocidad o tiempo de la acción muscular. La disminución con la edad en la capacidad aeróbica máxima se ha relacionado principalmente con una reducción en el débito cardíaco, determinada en parte por una reducción en el volumen de eyección sistólico y de la frecuencia máxima cardíaca y por menores cambios en las diferencias arteriovenosas de O2. Sin embargo, no queda del todo resuelto hasta qué punto la reducción en la fuerza máxima/explosiva observada con el envejecimiento puede también contribuir a la reducción en la potencia aeróbica máxima.

La estimación durante el ejercicio de la cinética de la concentración sanguínea de lactato, se ha definido como un indicador fisiológico válido de la habilidad para mantener un elevado VO2máx durante ejercicios de tipo submáximo. Esta relación es debida a que se ha observado que la concentración sanguínea de lactato cambia independientemente a otro tipo de factores y está más relacionada con la resistencia aeróbica que la determinación de la potencia aeróbica máxima. Sin embargo, no existe demasiada información acerca de la cinética de la concentración de lactato durante un ejercicio progresivo en personas de avanzada edad y en qué medida los cambios asociados con la edad en la fuerza máxima y masa muscular pueden influir sobre la respuesta de la concentración de lactato durante un ejercicio en cicloergómetro.

También se ha observado cómo el metabolismo del sistema muscular está bajo control hormonal y que las concentraciones de hormonas androgénicas juegan un papel importante en la hipertrofia muscular y el desarrollo de la fuerza. Los cambios asociados con la edad de la masa muscular y la fuerza máxima/explosiva y de la potencia aeróbica máxima pueden estar determinados en parte por alteraciones en el balance hormonal. Sin embargo, existen pocos estudios que examinen en qué medida los resultados en la producción de fuerza máxima y resistencia aeróbica pueden estar relacionados con los niveles circulantes de hormonas séricas en adultos y personas de avanzada edad. Desde el punto de vista científico y práctico es de gran interés examinar hasta qué punto la disminución asociada con la edad en la producción de fuerza máxima/explosiva y la masa muscular puede influenciar la respuesta submáxima a un ejercicio en cicloergómetro y si ésta puede estar relacionada con las alteraciones en el balance hormonal con el envejecimiento.

El objetivo de presente trabajo fue examinar las diferencias en 1) fuerza máxima/potencia y masa muscular, 2) características máximas y submáximas de resistencia en cicloergómetro y 3) relación entre la producción de fuerza máxima/explosiva y la potencia aeróbica máxima. Asimismo, se examinaron las posibles relaciones entre las características musculares de fuerza máxima y explosiva, potencia aeróbica máxima y las concentraciones séricas de hormonas [testosterona total (TT), testosterona libre (TL) y cortisol (C)]en hombres de mediana y avanzada edad.

Material y métodos. Se examinaron en 26 hombres de mediana edad (H42) (rango 35-46 años) y 21 de avanzada edad (H65) (rango 60-74 años), la fuerza máxima unilateral de los extensores de la rodilla (isométrica; FMIER y concéntrica; 1RMER), las curvas de potencia-carga durante acciones concéntricas con pesos entre el 15 y el 70% de una repetición máxima desde la posición de semisentadilla (1RMSS), la actividad electromiográfica (EMG) de los músculos vasto lateral (VL), vasto medial (VM) y bíceps femoral (BF; porción larga), el área de la sección transversal muscular del grupo muscular cuádriceps femoral (ASTCF) y concentraciones séricas hormonales (testosterona total, testosterona libre y cortisol). Asimismo, se registró la máxima carga de trabajo (Wmax), las cargas de trabajo asociadas a una concentración de lactato de 2 mmol.l-1 (W2) y 4 mmol.l-1 (W4), la frecuencia cardíaca y la cinética de la concentración sanguínea de lactato durante una prueba incremental progresiva en cicloergómetro.

Resultados

Fuerza máxima y potencia muscular

La fuerza máxima bilateral concéntrica 1RMSS (14%), FMIER (24%) y ASTCF (13%) fueron menores en H65 que en H42 (p<0,05-0,01). Los valores de potencia muscular durante las acciones concéntricas con cargas submáximas fueron inferiores (p<0,05-0,001) en H65 que en H42 (Fig. 1A). La máxima potencia fue desarrollada con unas cargas del 60% (486 ± 20 W) y 70% (391 ± 28 W) de la 1RMSS para H42 y H65, respectivamente. Cuando los valores de la potencia muscular desarrollada con cargas submáximas fueron expresadas relativas al peso corporal (W Kg-1), las diferencias observadas entre H65 y H42 fueron reducidas (Fig. 1B). Así, la potencia media absoluta producida con la fuerza máxima concéntrica (1RMSS) en H42 fue un 28% mayor (p<0,001) que en H65, y esta diferencia fue reducida al 22% (p<0,05) cuando la potencia fue expresada relativa al peso corporal. Cuando la potencia fue expresada relativa al AST del grupo muscular CF, la diferencias entre los jóvenes y mayores en las cargas submáxima desaparecieron (Fig. 1C) a excepción de la potencia desarrollada con la máxima carga que en H42 fue mayor (6,11± 1,8 W cm-2) (p<0,05) que en H65 (4,98± 1,6 W cm-2).

La activación muscular antagonista durante las acciones isométricas y dinámicas de extensión de rodilla fue mayor (p<0,01-0,001) en H65 que en H42 (Fig. 2). También el valor iEMG de activación antagonista (VM+VL) durante la acción de fuerza máxima isométrica de los flexores de la rodilla en H65 fue mayor (n.s) que en H42.

Test en cicloergómetro

Durante la prueba en cicloergómetro, la máxima potencia (Wmax) (31%), máxima frecuencia cardíaca (11%) y el pico de lactato sanguíneo (20%) fueron menores en H65 que el registrado en H42. Las concentraciones de lactato sanguíneo durante cargas submáximas se elevaron más rápidamente en H65 que en H42 (p<0,05-0,001) (Fig. 3), pero las diferencias desaparecieron cuando la carga de trabajo fue expresada en valores relativos al ASTCF. Los valores máximos y submáximos de carga de trabajo desarrollada durante la prueba en el cicloergómetro en el grupo H65 se relacionaron (desde r=0,44 hasta 0,55; p<0,05-0,01) con los valores individuales de la fuerza máxima concéntrica 1RMSS, y con la producción de potencia muscular con cargas desde el 30% hasta el 60% de 1RMSS (desde r=0,46 hasta 0,56; p<0,05-0,01) en H42 (Tabla 1).

Hormonas séricas

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones séricas medias de testosterona total o cortisol. Sin embargo, la concentración sérica media de testosterona libre de 66,5 ± 19 pmol l-1 en H42 fue mayor (p<0,05) que la observada de 55,3 ± 13 pmol l-1 en H65. El análisis de regresión múltiple mostró relaciones significativas entre los valores individuales de fuerza máxima y la razón testosterona libre/cortisol (R2=0,2 y 0,36; p<0,05-0,01) y cortisol (R2=-0,18 y -0,4; p<0,05-0,01), además de entre los valores individuales de testosterona total y la máxima carga de trabajo alcanzada en el test de bicicleta en H42 y H65, respectivamente.

Discusión.

El envejecimiento se asoció con una disminución en la producción de fuerza máxima, el área de la sección transversal muscular, la concentración de testosterona libre y la resistencia aeróbica, aunque la generación de potencia muscular y la demanda de energía aeróbica por unidad de tejido muscular durante cargas submáximas fue similar en las personas de avanzada y mediana edad. La activación voluntaria de los músculos agonistas y antagonistas parece variar dependiendo del tipo de acción muscular y/o tiempo de duración en ambos grupos estudiados y la mayor coactivación antagonista registrada en el grupo de mayor edad puede limitar la función de la musculatura agonista, especialmente en las acciones de tipo dinámico. Las relaciones significativas encontradas en H65 entre los valores individuales de la razones testosterona total y libre/cortisol y los valores individuales de la fuerza máxima, sugieren que con el paso de los años el balance entre las concentraciones circulantes de hormonas anabólicas y catabólicas en personas mayores tiene una cierta asociación con la producción voluntaria de fuerza por el sistema neuromuscular. La disminución de la potencia aeróbica en el test de cicloergómetro con el envejecimiento puede estar en parte relacionada con la reducción en la producción de fuerza máxima y masa muscular, posiblemente asociada en parte con una reducción en la actividad androgénica.

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